Efficient production of useful oil in microalgae and oilseed plants by modification of lipid metabolic pathway.

• Project Area: Creation of Complex Functional Molecules by Rational Redesign of Biosynthetic Machineries
• Project/Area Number: 19H04655
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Kindai University
• Principal Investigator: 梶川 昌孝 近畿大学, 生物理工学部, 講師 (40594437)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2021-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥7,540,000 (Direct Cost: ¥5,800,000、Indirect Cost: ¥1,740,000); Fiscal Year 2020: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000); Fiscal Year 2019: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
• Keywords: 分子育種 / エストライド脂質 / 珪藻 / 機能スクリーニング / 分裂酵母 / アクティベーションタギング / 植物代謝工学 / 脂質代謝 / 有用物質生産 / 植物脂質 / 藻類脂質 / ツノケイソウ

Outline of Research at the Start

水酸化脂肪酸に他の脂肪酸がエステル結合した脂質であるエストライドは、化学的、薬理学的に優れた特性をもち、安定的な供給システムの構築が求められる。ツノケイソウは水酸化脂肪酸のリシノール酸をエストライド化してトリアシルグリセロール分子内に蓄積したことから、エストライド化酵素遺伝子をツノケイソウより同定し利用することを目的とする。ツノケイソウの脂質量全体を底上げするために、モデル緑藻の脂質蓄積抑制因子のツノケイソウのオルソログ遺伝子をゲノム編集によって遺伝子破壊する。油糧植物のナガミノアマナズナ種子および油糧酵母においてもエストライド化酵素を発現させ、多角的なエストライド脂質生産の基盤を整える。

Outline of Annual Research Achievements

エストライド脂質は水酸基をもつ脂肪酸に他の脂肪酸が１分子エステル結合して連結した二量体構造を含む脂質である。エストライド脂質の生産と活用のため、ツノケイソウのエストライド化を担う生合成遺伝子を同定することを目的とした。そのため、ツノケイソウのcDNA発現ライブラリーを発現させた分裂酵母を用いた機能スクリーニングを行った。培養温度20℃での振盪培養において、4 mg/mlのリシノール酸を培養液に添加した場合には60日以上完全に生育を抑制することがわかった。cDNAライブラリーを導入した分裂酵母を4 mg/mlのリシノール酸添加条件でバルク培養したところ、38日後に増殖が始まり45日後には定常期まで達した。また細胞からはエストライドTAGが検出された。さらに増殖した細胞はツノケイソウの機能未知の遺伝子が導入されていることがわかった。
ツノケイソウの中性脂質蓄積量の底上げを目的とし、ノケイソウの変異株集団の中から脂質蓄積異常株を探索して新規制御因子の単離を試みた。ツノケイソウで順遺伝学的解析を行うための工夫として高発現プロモーターのゲノムへのランダム挿入によるアクティベーションタギングを用いた。高発現プロモーターとしてツノケイソウの内在性の硝酸還元酵素遺伝子CgNRのプロモーターを用いた。約5,000株の独立した形質転換株を単離し、ナイルレッド蛍光を指標に中性脂質蓄積異常を示す変異株、すなわち野生株と比べて脂質蓄積量の高い株および低い株の両方を選抜した。その結果、ナイルレッド蛍光値、中性脂質蓄積量がともに野生株と比べて約50％まで減少した46C1株が単離された。46C1株ではプロテアーゼドメインをもつ遺伝子の転写開始点上流に導入したプロモーター配列が順向きに挿入されていた。

Research Progress Status

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Raman image-activated cell sorting. (2020)
  • Author(s): Nitta et al.
  • Journal Title: Nature communications Volume: 11 Issue: 1 Pages: 3452-3452
  • DOI: 10.1038/s41467-020-17285-3
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Algal Autophagy Is Necessary for the Regulation of Carbon Metabolism Under Nutrient Deficiency (2020)
  • Author(s): Kajikawa, M., Fukuzawa, H.
  • Journal Title: Front. Plant Sci. Volume: 11 Pages: 35-35
  • DOI: 10.3389/fpls.2020.00036
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Lipid remodeling regulator 1 (LRL1) is differently involved in the phosphorus‐depletion response from PSR1 in Chlamydomonas reinhardtii (2019)
  • Author(s): Hidayati Nur A.、Yamada‐Oshima Yui、Iwai Masako、Yamano Takashi、Kajikawa Masataka、Sakurai Nozomu、Suda Kunihiro、Sesoko Kanami、Hori Koichi、Obayashi Takeshi、Shimojima Mie、Fukuzawa Hideya、Ohta Hiroyuki
  • Journal Title: The Plant Journal Volume: 100 Issue: 3 Pages: 610-626
  • DOI: 10.1111/tpj.14473
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The bZIP transcription factor regulates lipid remodeling and contributes to ER stress management in Chlamydomonas reinhardtii. (2019)
  • Author(s): Yamaoka Y, Shin S, Choi BY, Kim H, Jang S, Kajikawa M, Yamano T, Kong F, Legeret B, Fukuzawa H, Li-Beisson Y, Lee Y.
  • Journal Title: Plant Cell Volume: 31 Issue: 5 Pages: 1127-1140
  • DOI: 10.1105/tpc.18.00723
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Algal Protein Kinase, Triacylglycerol Accumulation Regulator 1, Modulates Cell Viability and Gametogenesis in Carbon/Nitrogen-Imbalanced Conditions (2019)
  • Author(s): Shinkawa H, Kajikawa M, Nomura Y, Ogura M, Sawaragi Y, Yamano T, Nakagami H, Sugiyama N, Ishihama Y, Kanesaki Y, Yoshikawa H, Fukuzawa H
  • Journal Title: Plant and Cell Physiology Volume: 60 Issue: 4 Pages: 916-930
  • DOI: 10.1093/pcp/pcz010
  • NAID: 120006823940
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 貧栄養環境での生存に必要な藻類の新奇因子の探索 (2020)
  • Author(s): 梶川昌孝
  • Organizer: 藻類談話会
  • Invited
• [Presentation] 藻類のタンパク質リン酸化酵素Triacylglycerol Accumulation Regulator1 はC/N ストレス条件下における細胞生存率と配偶子誘導を制御 する (2020)
  • Author(s): 新川はるか，梶川昌孝，椹木裕里，山野隆志，兼崎友，吉川博文，福澤秀哉
  • Organizer: 第61日本植物生理学会年会
• [Presentation] 高CO2 かつ窒素欠乏条件でTAG を高蓄積する緑藻クラミドモナスの変異体B10 株の解析 (2020)
  • Author(s): 長房すずか，宮本あすか，新川はるか，新川友貴，山野隆志，辻敬典，梶川昌孝，福澤秀哉
  • Organizer: 第61日本植物生理学会年会
• [Presentation] C/N ストレス条件で脂質を高蓄積する緑藻変異株ccdc124 (2019)
  • Author(s): 長房すずか、宮本明日香、新川はるか、新川友貴、山野隆志、 辻敬典、梶川昌孝、福澤秀哉
  • Organizer: 第32回植物脂質シンポジウム
• [Presentation] ゼニゴケDYRK型タンパク質リン酸化酵素MpYak1は、無性芽の休眠と生殖器誘導の制御に関与する (2019)
  • Author(s): 新川はるか、梶川昌孝、西浜竜一、河内孝之、福澤秀哉
  • Organizer: 日本植物学会第83回大会
• [Presentation] オートファジーに依存した緑藻Chlamydomonas reinhardtii の生存と油脂蓄積 (2019)
  • Author(s): 梶川 昌孝、山内 万里花、新川 はるか、田中 学、幡野 恭子、西村 芳樹、加藤 美砂子、福澤 秀哉
  • Organizer: 日本藻類学会第43回大会
• [Presentation] Production of ricinoleic acid-containing monoestolide triacylglycerides in an oleaginous diatom, Chaetoceros gracilis (2019)
  • Author(s): 梶川 昌孝
  • Organizer: 12th International Symposium Exploring the Global Sustainability
  • Int'l Joint Research / Invited