ロドプシンによる葉緑体プロトン勾配制御システムの確立と植物応答解析への展開

• Project Area: New Photosynthesis : Reoptimization of the solar energy conversion system
• Project/Area Number: 19H04727
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 須藤 雄気 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (10452202)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2021-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥7,540,000 (Direct Cost: ¥5,800,000、Indirect Cost: ¥1,740,000); Fiscal Year 2020: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000); Fiscal Year 2019: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
• Keywords: ロドプシン / 光 / 生物物理 / オプトジェネティクス / エネルギー変換 / プロトンポンプ / NPQ

Outline of Research at the Start

植物による光合成は、水と二酸化炭素から、炭素固定・酸素発生・ATP産生を行う反応で、生命活動の源でもある。植物には、光強度にあわせて余剰なエネルギーを熱として放出する機構（NPQ）が備わっており、これにより効率的な光合成が実現する。NPQは、プロトン濃度上昇が引き金とされているが、その制御機構はよくわかっていない。本研究では、光合成色素がほとんど吸収しない緑色光で働くロドプシンを植物の葉緑体に発現させ、人為的に膜を介したプロトン移動を誘起する。これにより擬似的に強・弱光条件を再現し、NPQ制御メカニズムを解明する。

Outline of Annual Research Achievements

植物による光合成は、水と二酸化炭素から炭素固定・酸素発生・ATP産生を行う反応であある。ここで、生物のエネルギー通貨とも呼ばれるATPは、光合成タンパ
ク質における細胞内から細胞外にプロトン（H+）の輸送により実現している。また、植物には光強度にあわせて余剰なエネルギーを熱として放出する機構（NonPhotochemical Quenching：NPQ）が備わっており、効率的な光合成を実現している。これらは光合成に伴う葉緑体ルーメン側の酸性化（プロトン濃度上昇）が引き金になることがわかっているが、その制御機構の詳細は不明である。本研究では、光合成色素クロロフィルがほとんど吸収しない緑色光で働くロドプシンを緑藻（クラミドモナス）および陸上植物（シロイヌナズナ）の葉緑体に異種発現させる組み換え体を創出する。次に、ロドプシンを光により励起し、人為的に膜を介したプロトン移動を誘起する。これにより、擬似的に強・弱光条件を作り出し、その際に起こる植物応答（ATP合成、NPQ制御、成長、形態、その他）を光で制御し、それらのメカニズムの解明を目指す。

本年度は、以下の生化学的・細胞生物学的解析を行った。
①生化学的解析：クラミドモナスおよびシロイヌナズナにおけるロドプシンの発現。加えて、葉緑体への局在の確認。クラミドモナスおよびシロイヌナズナともに、ロドプシンの葉緑体への発現と局在を確認した。
②細胞生物学的解析：NPQをはじめとした応答解析を進めた。（１）クラミドモナスについては、NPQ誘導の確認に加え、細胞形態や生育などへのロドプシンおよび光の影響を検討し、ロドプシンによる成長促進を確認した。（２）シロイヌナズナについては、上記に加えレチナールの添加法の検討と、レチナールが及ぼす細胞毒性について検討した。

Research Progress Status

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] モンテレーベイ水族館(米国)
• [Int'l Joint Research] ワイズマン研究所(イスラエル)
• [Journal Article] Further thermo‐stabilization of thermophilic rhodopsin from Thermus thermophilus JL ‐18 through engineering in extramembrane regions (2021)
  • Author(s): Akiyama Tomoki、Kunishima Naoki、Nemoto Sayaka、Kazama Kazuki、Hirose Masako、Sudo Yuki、Matsuura Yoshinori、Naitow Hisashi、Murata Takeshi
  • Journal Title: Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics Volume: 89 Issue: 3 Pages: 301-310
  • DOI: 10.1002/prot.26015
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Mechanism of absorption wavelength shifts in anion channelrhodopsin-1 mutants (2021)
  • Author(s): Tsujimura Masaki、Noji Tomoyasu、Saito Keisuke、Kojima Keiichi、Sudo Yuki、Ishikita Hiroshi
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics Volume: 1862 Issue: 2 Pages: 148349-148349
  • DOI: 10.1016/j.bbabio.2020.148349
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] マルチタレント光受容タンパク質「ロドプシン」 (2021)
  • Author(s): 須藤雄気、小島慧一
  • Journal Title: 現代化学 Volume: 5 Pages: 50-53
• [Journal Article] Lokiarchaeota archaeon schizorhodopsin-2 (LaSzR2) is an inward proton pump displaying a characteristic feature of acid-induced spectral blue-shift (2020)
  • Author(s): Kojima Keiichi、Yoshizawa Susumu、Hasegawa Masumi、Nakama Masaki、Kurihara Marie、Kikukawa Takashi、Sudo Yuki
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 10 Issue: 1 Pages: 20857-20857
  • DOI: 10.1038/s41598-020-77936-9
  • NAID: 120006955824
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Applicability of Styrene-Maleic Acid Copolymer for Two Microbial Rhodopsins, RxR and HsSRI. (2020)
  • Author(s): Tetsuya Ueta, Keiichi Kojima, Tomoya Hino, Mikihiro Shibata, Shingo Nagano, Yuki Sudo*
  • Journal Title: Biophysical journal Volume: 119 Issue: 9 Pages: 1760-1770
  • DOI: 10.1016/j.bpj.2020.09.026
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Comparative Studies of the Fluorescence Properties of Microbial Rhodopsins: Spontaneous Emission Versus Photointermediate Fluorescence (2020)
  • Author(s): Kojima Keiichi、Kurihara Rika、Sakamoto Masayuki、Takanashi Tsukasa、Kuramochi Hikaru、Zhang Xiao Min、Bito Haruhiko、Tahara Tahei、Sudo Yuki
  • Journal Title: The Journal of Physical Chemistry B Volume: 124 Issue: 34 Pages: 7361-7367
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.0c06560
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Green-Sensitive, Long-Lived, Step-Functional Anion Channelrhodopsin-2 Variant as a High-Potential Neural Silencing Tool (2020)
  • Author(s): Kojima Keiichi、Miyoshi Natsuki、Shibukawa Atsushi、Chowdhury Srikanta、Tsujimura Masaki、Noji Tomoyasu、Ishikita Hiroshi、Yamanaka Akihiro、Sudo Yuki
  • Journal Title: The Journal of Physical Chemistry Letters Volume: 11 Issue: 15 Pages: 6214-6218
  • DOI: 10.1021/acs.jpclett.0c01406
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] A unique clade of light-driven proton-pumping rhodopsins evolved in the cyanobacterial lineage (2020)
  • Author(s): Hasegawa Masumi、Hosaka Toshiaki、Kojima Keiichi、Nishimura Yosuke、Nakajima Yu、Kimura-Someya Tomomi、Shirouzu Mikako、Sudo Yuki、Yoshizawa Susumu
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 10 Issue: 1 Pages: 16752-16752
  • DOI: 10.1038/s41598-020-73606-y
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Interaction of Escherichia coli and its culture supernatant with Vibrio vulnificus during biofilm formation (2020)
  • Author(s): Ohn Han‐Min、Mizuno Tamaki、Sudo Yuki、Miyoshi Shin‐Ichi
  • Journal Title: Microbiology and Immunology Volume: 64 Issue: 9 Pages: 593-601
  • DOI: 10.1111/1348-0421.12829
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Bacterium Lacking a Known Gene for Retinal Biosynthesis Constructs Functional Rhodopsins (2020)
  • Author(s): Nakajima Yu、Kojima Keiichi、Kashiyama Yuichiro、Doi Satoko、Nakai Ryosuke、Sudo Yuki、Kogure Kazuhiro、Yoshizawa Susumu
  • Journal Title: Microbes and Environments Volume: 35 Issue: 4 Pages: n/a-n/a
  • DOI: 10.1264/jsme2.me20085
  • NAID: 130007950468
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Diversity and Potential of Microbial Rhodopsins (2020)
  • Author(s): 須藤雄気、小島慧一
  • Journal Title: Seibutsu Butsuri Volume: 60 Issue: 4 Pages: 209-214
  • DOI: 10.2142/biophys.60.209
  • NAID: 130007881674
  • ISSN: 0582-4052, 1347-4219
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Vectorial Proton Transport Mechanism of RxR, a Phylogenetically Distinct and Thermally Stable Microbial Rhodopsin (2020)
  • Author(s): Kojima Keiichi、Ueta Tetsuya、Noji Tomoyasu、Saito Keisuke、Kanehara Kanae、Yoshizawa Susumu、Ishikita Hiroshi、Sudo Yuki
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 10 Issue: 1 Pages: 1-11
  • DOI: 10.1038/s41598-019-57122-2
  • NAID: 120006884916
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The Unlimited Potential of Microbial Rhodopsins as Optical Tools (2020)
  • Author(s): Kojima K, Shibukawa A, Sudo Y
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 59(3) Issue: 3 Pages: 218-229
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.9b00768
  • NAID: 120006939595
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] How Does a Microbial Rhodopsin RxR Realize Its Exceptionally High Thermostability with the Proton-Pumping Function Being Retained? (2020)
  • Author(s): Hayashi Tomohiko、Yasuda Satoshi、Suzuki Kano、Akiyama Tomoki、Kanehara Kanae、Kojima Keiichi、Tanabe Mikio、Kato Ryuichi、Senda Toshiya、Sudo Yuki、Murata Takeshi、Kinoshita Masahiro
  • Journal Title: The Journal of Physical Chemistry B Volume: 124 Issue: 6 Pages: 990-1000
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.9b10700
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Methodology for Further Thermostabilization of an Intrinsically Thermostable Membrane Protein Using Amino Acid Mutations with Its Original Function Being Retained (2020)
  • Author(s): Yasuda Satoshi、Akiyama Tomoki、Nemoto Sayaka、Hayashi Tomohiko、Ueta Tetsuya、Kojima Keiichi、Tsukamoto Takashi、Nagatoishi Satoru、Tsumoto Kouhei、Sudo Yuki、Kinoshita Masahiro、Murata Takeshi
  • Journal Title: Journal of Chemical Information and Modeling Volume: 60 Issue: 3 Pages: 1709-1716
  • DOI: 10.1021/acs.jcim.0c00063
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Photochemical Characterization of a New Heliorhodopsin from the Gram-Negative Eubacterium Bellilinea caldifistulae (BcHeR) and Comparison with Heliorhodopsin-48C12 (2019)
  • Author(s): Shibukawa A, Kojima K, Nakajima Y, Nishimura Y, Yoshizawa S, Sudo Y
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 58(26) Issue: 26 Pages: 2934-2943
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.9b00257
  • NAID: 120006847070
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Quantitation of the neural silencing activity of anion channelrhodopsins in Caenorhabditis elegans and their applicability for long-term illumination (2019)
  • Author(s): Yamanashi T, Maki M, Kojima K, Shibukawa A, Tsukamoto T, Chowdhury S, Yamanaka A, Takagi S, Sudo Y
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 9(1) Issue: 1 Pages: 7863-7863
  • DOI: 10.1038/s41598-019-44308-x
  • NAID: 120006733902
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A distinct lineage of giant viruses brings a rhodopsin photosystem to unicellular marine predators (2019)
  • Author(s): Needham David M.、Yoshizawa Susumu、Hosaka Toshiaki et. al.
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 116 Issue: 41 Pages: 20574-20583
  • DOI: 10.1073/pnas.1907517116
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] GABA neurons in the ventral tegmental area regulate non-rapid eye movement sleep in mice (2019)
  • Author(s): Chowdhury Srikanta、Matsubara Takanori、Miyazaki Toh、Ono Daisuke、Fukatsu Noriaki、Abe Manabu、Sakimura Kenji、Sudo Yuki、Yamanaka Akihiro
  • Journal Title: eLife Volume: 8
  • DOI: 10.7554/elife.44928
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Application of High-Sensitivity UV photoemission Spectroscopy to Examine the Electronic Structure of Thermophilic Rhodopsin (2019)
  • Author(s): Sano Daisuke、Ide Ichiro、Akiyama Tomoki、Tanaka Yuya、Sudo Yuki、Murata Takeshi、Ishii Hisao
  • Journal Title: Molecular Crystals and Liquid Crystals Volume: 687 Issue: 1 Pages: 34-39
  • DOI: 10.1080/15421406.2019.1648052
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 『光 が くすりになる！？』 (2020)
  • Author(s): 須藤雄気
  • Organizer: 第８回青陵サイエンストーク
  • Invited
• [Presentation] ロドプシンの生物物理化学研究： 光 が くすりになる！？ (2019)
  • Author(s): 須藤雄気
  • Organizer: 第141回（2019年）・日本薬学会中国四国支部例会
  • Invited
• [Presentation] 『光 が くすりになる！？』 (2019)
  • Author(s): 須藤雄気
  • Organizer: 岡山大学病院・市民フォーラム2019
  • Invited
• [Presentation] A bottom-up approach to Utilizing Microbial Rhodopsins for Optogenetics (2019)
  • Author(s): Yuki Sudo
  • Organizer: 2019 ESP-IUPB World Congress
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 微生物型 ロドプシンによる ボトムアップ型 光操作ツール開発 (2019)
  • Author(s): 須藤雄気
  • Organizer: ISSPワークショップ 「レチナールタンパク質の光機能発現の物理と化学」
  • Invited
• [Presentation] Promoting Optogenetics by Microbial Rhodopsins (2019)
  • Author(s): 須藤雄気
  • Organizer: 第11回・光操作研究会
  • Invited
• [Remarks] 研究室ホームページ
  • URL: http://www.pharm.okayama-u.ac.jp/lab/bukka/
• [Patent(Industrial Property Rights)] 光により細胞死を制御する方法 (2020)
  • Inventor(s): 須藤雄気、小島慧一、中尾新
  • Industrial Property Rights Holder: 須藤雄気、小島慧一、中尾新
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2020-196718
  • Filing Date: 2020
• [Patent(Industrial Property Rights)] 膜電位センサー (2020)
  • Inventor(s): 坂本雅行、チョウシャオミン、尾藤晴彦、須藤雄気、小島慧一
  • Industrial Property Rights Holder: 坂本雅行、チョウシャオミン、尾藤晴彦、須藤雄気、小島慧一
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2020-070136
  • Filing Date: 2020