1細胞レベル・高時空間的解像度でのウイルス共生運命決定の分子機構の解析

Publicly Offered Research

Project Area	Neo-virology: the raison d'etre of viruses
Project/Area Number	19H04838
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
Allocation Type	Single-year Grants
Review Section	Biological Sciences
Research Institution	Gunma University (2020) Kyushu University (2019)
Principal Investigator	小松哲郎群馬大学, 生体調節研究所, 講師 (70614824)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2021-03-31
Project Status	Completed (Fiscal Year 2020)
Budget Amount *help	¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000) Fiscal Year 2020: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000) Fiscal Year 2019: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Keywords	アデノウィルス / NGS / イメージング / ウイルス学 / 1細胞RNA-seq / ライブセルイメージング / アデノウイルス
Outline of Research at the Start	ウイルスの生活環には、宿主の疾患等を引き起こす溶解感染と安定的に宿主と共生する潜伏感染が存在する。しかし、この２つの「運命」を決定する分子基盤は明らかとされていない。本研究では、生きた細胞内でのウイルス可視化技術、1細胞レベルでの遺伝子発現解析法といった最新技術を駆使し、ウイルス感染における溶解-潜伏感染の運命が「いつ」「どこで」「どのように」決定するかを明らかにすることを目指す。
Outline of Annual Research Achievements	ウイルスの生活環には、宿主の疾患を引き起こす溶解感染と、安定的に宿主と共生する潜伏感染が存在する。しかし、この「運命」を決定する分子基盤は明らかとされていない。本研究では、アデノウイルスをモデル系に次世代シークエンサー（NGS）解析とイメージング技術を組み合わせ、溶解-潜伏感染の運命決定機構を明らかにすることを目的とした。当初、アデノウイルス感染細胞の1細胞RNA-seq解析の実施を計画していた。しかし、並行して進めていた細胞集団を対象としたトランスクリプトーム解析(RNA-seq)、クロマチン構造解析(MNase-seq)において高いクオリティのNGSデータが得られたため、これら解析から得られた知見を元にイメージング技術を行い1細胞レベルでの解析を行うこととした。MNase-seqによりウイルスクロマチン構造を1塩基レベルで解析した結果、宿主クロマチンとは異なる60-70 bpのDNA長を基本単位としたウイルスヌクレオソーム様構造がゲノム全域にわたり配置されていることが明らかとなった。興味深いことに、RNA-seqでは感染時間の経過に伴うウイルス遺伝子発現の変化が検出されたのに対し、MNase-seqではウイルスクロマチン構造の時間経過に伴う変化はほとんど検出されなかった。このことから、感染細胞内において一部のウイルスゲノムのみがクロマチン構造変換を伴う遺伝子発現に寄与している可能性を考えた。そこで、免疫染色およびウイルスmRNAに対する一分子FISH法を実施し感染細胞内におけるウイルスゲノムと転写産物を可視化しイメージング解析を実施した。結果、細胞内に存在するウイルスゲノムのうち、約20%のみが転写活性化状態であることが示唆された（論文投稿中）。今後はRNA-seqデータの解析を進め、転写活性化型、不活性型ウイルスゲノムに対する宿主細胞の応答の詳細解明を目指す。
Research Progress Status	令和2年度が最終年度であるため、記入しない。
Strategy for Future Research Activity	令和2年度が最終年度であるため、記入しない。