14-3-3タンパク質によるリン酸化シグナル経路の熱力学的・構造生物学的基盤

• Project Area: Integrative understanding of biological signaling networks based on mathematical science
• Project/Area Number: 19H04973
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 大澤 匡範 慶應義塾大学, 薬学部(芝共立), 教授 (60361606)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2021-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000); Fiscal Year 2020: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000); Fiscal Year 2019: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000)
• Keywords: リン酸化シグナル / 14-3-3 / FoxO3 / NMR / リン酸化シグナル経路 / 14-3-3タンパク質 / 構造生物学 / 結合親和性 / 複合体構造

Outline of Research at the Start

多くのがん細胞においては、Ras タンパク質の活性化を起源として、その下流にあるキナーゼを活性化し、そのキナーゼは連鎖的に別のキナーゼをリン酸化・活性化する、というリン酸化シグナルが亢進している。そのシグナルを持続させる機能をもつタンパク質が14-3-3タンパク質である。本研究では、この14-3-3タンパク質がいかにしてリン酸化シグナルを持続させるのかを定量的に、かつ、タンパク質の立体構造の観点より解明することにより、この過程を数理モデル化して理解することを目的としている。このメカニズムが解明できれば、リン酸化シグナルを抑制する革新的な制がん剤の創製につながると考えている。

Outline of Annual Research Achievements

FoxO3aは、アポトーシスを促進する転写因子である。がん細胞ではRasの変異を起源とするリン酸化シグナリングが亢進しており、FoxO3aはその下流に位置する。Ser/ThrキナーゼAKTにより2か所リン酸化を受けたFoxO3a (dpFoxO3a) はアダプタータンパク質14-3-3ζと結合するとともにDNAから解離し転写活性が低下する結果、がん細胞のアポトーシスが抑制され、がん細胞の増殖・悪性化につながる。したがって、14-3-3ζとdpFoxO3aの相互作用機構を原子レベルで明らかにできれば、がんの増悪機構の解明につながり、この相互作用阻害を標的とした新たながん治療薬の創製にも寄与できる。そこで本研究では、14-3-3ζとdpFoxO3aの相互作用を構造生物学的に解明することを目的とした。ヒト14-3-3ζおよびFoxO3a（残基番号1‐284; DNA結合ドメイン (DBD, 残基番号153‐253) とリン酸化部位T32, S253を含む領域）の大量調製法・AKTによるFoxO3aリン酸化法を確立した。SEC-MALSとITCにより、dpFoxO3aは14-3-3ζの二量体と1:1の複合体を形成し、両者のKdは70 nMでありdpFoxO3a-DNA間のKd (=40 nM) とほぼ同等であった。また、均一15N標識dpFoxO3aを用いた1H-15N HSQC NMRスペクトルにより14-3-3ζおよびDNAの滴定実験を行ったところ、14-3-3ζはdpFoxO3aのリン酸化部位だけでなくDBDと直接相互作用しdpFoxO3aとDNAとの結合を阻害することが示唆された。今後、dpFoxO3a - 14-3-3ζ複合体の立体構造を解析し、阻害機構の原子レベルでの解明を目指す。

Research Progress Status

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] トロント大学(カナダ)
• [Journal Article] Mechanism of hERG inhibition by gating-modifier toxin, APETx1, deduced by functional characterization (2021)
  • Author(s): Matsumura Kazuki、Shimomura Takushi、Kubo Yoshihiro、Oka Takayuki、Kobayashi Naohiro、Imai Shunsuke、Yanase Naomi、Akimoto Madoka、Fukuda Masahiro、Yokogawa Mariko、Ikeda Kazuyoshi、Kurita Jun-ichi、Nishimura Yoshifumi、Shimada Ichio、Osawa Masanori
  • Journal Title: BMC Molecular and Cell Biology Volume: 22 Issue: 1 Pages: 1-16
  • DOI: 10.1186/s12860-020-00337-3
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Conformational equilibrium shift underlies altered K+ channel gating as revealed by NMR (2020)
  • Author(s): Iwahashi Yuta、Toyama Yuki、Imai Shunsuke、Itoh Hiroaki、Osawa Masanori、Inoue Masayuki、Shimada Ichio
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 11 Issue: 1 Pages: 5168-5168
  • DOI: 10.1038/s41467-020-19005-3
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] GZD824 Inhibits GCN2 and Sensitizes Cancer Cells to Amino Acid Starvation Stress (2020)
  • Author(s): Kato Yu、Kunimasa Kazuhiro、Takahashi Mizuki、Harada Ayaka、Nagasawa Ikuko、Osawa Masanori、Sugimoto Yoshikazu、Tomida Akihiro
  • Journal Title: Molecular Pharmacology Volume: 98 Issue: 6 Pages: 669-676
  • DOI: 10.1124/molpharm.120.000070
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural mechanism underlying G protein family-specific regulation of G protein-gated inwardly rectifying potassium channel (2019)
  • Author(s): Kano Hanaho、Toyama Yuki、Imai Shunsuke、Iwahashi Yuta、Mase Yoko、Yokogawa Mariko、Osawa Masanori、Shimada Ichio
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 10 Issue: 1 Pages: 1-13
  • DOI: 10.1038/s41467-019-10038-x
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 分子内ジスルフィド結合による電位依存性K+チャネルの膜電位依存的構 造変化機構の解明 (2021)
  • Author(s): 原田 彩佳、石川 貴大、横川 真梨子、前田 知輝、日向寺 孝禎、藤田 浩平、野崎 智裕、嶋田 一夫、大澤 匡範
  • Organizer: 日本薬学会 第141年会
• [Presentation] B型肝炎ウイルスの肝細胞特異的な侵入機構の解明 (2020)
  • Author(s): 石場 智彬, 横川 真梨子, 横田 旭美, 室井 大輝, 大澤 匡範
  • Organizer: 第43回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] PABP-interacting Protein 2による翻訳抑制機構の解明 (2020)
  • Author(s): 寒河江 彪流, 横川 真梨子, 沢崎 綾一, 細田 直, 星野 真一, 大澤 匡範
  • Organizer: 第43回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] Gating-modifier toxin APETx1による電位依存性カリウムイオンチャネルhERG阻害機構の解析 (2020)
  • Author(s): 松村 一輝, 下村 拓史, 久保 義弘, 岡 貴之, 小林 直宏, 今井 駿輔, 簗瀬 尚美, 秋元 まどか, 福田 昌弘, 横川 真梨子, 池田 和由, 栗田 順一, 西村 善文, 嶋田一夫, 大澤匡範
  • Organizer: 第43回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] Structural basis for the hepatocyte-specific entry of hepatitis B virus (2020)
  • Author(s): Tomoaki Ishiba, Mariko Yokogawa, Terumi Yokota, Taiki Muroi, Masanori Osawa
  • Organizer: 第20回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] Structural Mechanism of Translational Repression by PABP-interacting Protein 2 (2020)
  • Author(s): Takeru Sagae, Mariko Yokogawa, Ryoichi Sawazaki, Nao Hosoda, Shin-ichi Hoshino, Masanori Osawa
  • Organizer: 第20回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] BTG2によるポリ A 分解促進機構の構造生物学的解明 (2019)
  • Author(s): 高嶋大翔、城えりか、横川真梨子、沢崎綾一、寒河江彪流、尾上耕一、星野真一、大澤匡範
  • Organizer: 第63回 日本薬学会関東支部大会
• [Presentation] リン酸化による転写因子FOXO3aの機能抑制機構の解 (2019)
  • Author(s): 河津光作、中塚将一、横川真梨子、中村吏佐、木村友美、齋藤潤、佐谷秀行、大澤匡範
  • Organizer: 第63回 日本薬学会関東支部大会
• [Remarks] 慶應義塾大学薬学部 生命機能物理学講座
  • URL: http://square.umin.ac.jp/keio-skb/index.html
• [Remarks] 慶應義塾大学薬学部 生命機能物理学講座
  • URL: http://square.umin.ac.jp/keio-skb/