Regulation of nuclear periphery chromatin architecture by Rif1 through its binding to G-quadruplex

• Project Area: Chromatin potential for gene regulation
• Project/Area Number: 19H05277
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science
• Principal Investigator: 正井 久雄 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 所長 (40229349)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2021-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥8,450,000 (Direct Cost: ¥6,500,000、Indirect Cost: ¥1,950,000); Fiscal Year 2020: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2019: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
• Keywords: 複製タイミング / クロマチンループ / 染色体高次構造 / 核膜 / グアニン４重鎖DNA / RNA-DNAハイブリッド / 多量体形成 / パルミトイル化 / グアニン４重鎖 / クロマチンドメイン / DNA複製タイミング / Rif1 / DNA修復 / 転写

Outline of Research at the Start

進化的に保存された核因子Rif1は、酵母ではテロメア長の制御に関与するが、同時にDNA複製の時空間制御(特定のゲノム領域の複製が核内のどこで、いつ起こるか)の制御に重要な役割を果たす。また、Rif1はDSB修復や転写制御にも関与する。Rif1は代表的な非B型DNA構造である グアニン4重鎖(G4)を認識しクロマチンに結合し核膜近傍に複製に抑制的なクロマチンドメインを形成することを見出した。本研究では、Rif1がG4結合を介してどのようなメカニズムで核膜近傍に特有なクロマチンドメインを形成し、それにより複製、修復、転写が制御されるかを、その構造的基盤も含めて解明することを目標とする。

Outline of Annual Research Achievements

１）Rif1の核膜局在変異が複製、修復、転写、組換えなど種々の染色体動態に及ぼす影響の解析：　ヒト大腸癌細胞HCT116のRif1の完全欠失株、C末端のCys2450欠失、8aa欠損の変異体を樹立した。欠損株は増殖が低下するが、C末変異細胞株は野生型と遜色ない増殖を示した。一方、HU等複製ストレスに対する応答は影響を受けなかったが、X線による損傷に対する感受性は完全欠損株より低いが野生型より高かった。一方、複製タイミングは、Rif1欠損株とほぼ同様に大きく変化する。その変化は染色体特異的で、Rif1結合領域はRif1変異による後期→初期への変化が観察される。一方、Rif1が結合せず、H3K9meが高い領域はRif1変異による影響を受けにくかった。一般にGC含量が低く、複製タイミングが遅い染色体はRif1の影響を受けやすい。
２）Rif1の核膜局在の機構：　Rif1C末領域の変異により、核膜や核小体辺縁部への局在がみられなくなった。一方、Rif1はリン脂質修飾、特にパルミトイル化を受けることを証明した。パルミトイル化の候補部位を二箇所見出した。また、パルミトイル化を薬剤で阻害することにより、Rif1の変異体と同様な、複製シグナルの増強が観察された。
３）Rif1のG4認識の構造的基盤の解明：　分裂酵母C末ポリペプチドの変異体スクリーニングから、G4結合と多量体形成のそれぞれが、欠損を持つ変異体を同定した。これらの変異を全長Rif1に戻し、その機能をhsk1変異の相補能で検討した。いずれの変異も相補できることから、G4結合と多量体形成のいずれもが、Rif1の機能に必須であることが明らかとなった。ヒトRif1C末もG4結合と多量体形成能を有しており、多量体形成能は、C末59aa(2314-2472)に存在する。クロスリンクの結果から、C末領域は8-16量体まで形成し得ることが示された。

Research Progress Status

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Van Andel Research Institute(米国)
• [Journal Article] Detection of cellular G-quadruplex by using a loop structure as a structural determinant (2020)
  • Author(s): Masai Hisao、Kanoh Yutaka、Kakusho Naoko、Fukatsu Rino
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: 531 Issue: 1 Pages: 75-83
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2020.05.191
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] G-quadruplex DNA and RNA: Their roles in regulation of DNA replication and other biological functions (2020)
  • Author(s): Masai Hisao、Tanaka Taku
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: 531 Issue: 1 Pages: 25-38
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2020.05.132
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] G-quadruplexes: tools, roles, and goals (2020)
  • Author(s): Masai Hisao、Tan Zheng
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: 531 Issue: 1 Pages: 1-2
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2020.05.092
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] G-quadruplex binding protein Rif1, a key regulator of replication timing (2020)
  • Author(s): Alavi Sana、Ghadiri Hamed、Dabirmanesh Bahareh、Moriyama Kenji、Khajeh Khosro、Masai Hisao
  • Journal Title: The Journal of Biochemistry Volume: 169 Issue: 1 Pages: 1-14
  • DOI: 10.1093/jb/mvaa128
  • NAID: 40022490610
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] LDL-mimetic lipid nanoparticles prepared by surface KAT ligation for<i>in vivo</i>MRI of atherosclerosis (2020)
  • Author(s): Fracassi Alessandro、Cao Jianbo、Yoshizawa-Sugata Naoko、T?th ?va、Archer Corey、Gr?ninger Olivier、Ricciotti Emanuela、Tang Soon Yew、Handschin Stephan、Bourgeois Jean-Pascal、Ray Ankita、Liosi Korinne、Oriana Sean、Stark Wendelin、Masai Hisao、Zhou Rong、Yamakoshi Yoko
  • Journal Title: Chemical Science Volume: 11 Issue: 44 Pages: 11998-12008
  • DOI: 10.1039/d0sc04106h
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Cancer-derived UTX TPR mutations G137V and D336G impair interaction with MLL3/4 complexes and affect UTX subcellular localization. (2020)
  • Author(s): Kato H, Asamitsu K, Sun W, Kitajima S, Yoshizawa-Sugata N, Okamoto T, Masai H, Poellinger L
  • Journal Title: Oncogene. Volume: 39 Issue: 16 Pages: 3322-3335
  • DOI: 10.1038/s41388-020-1218-3
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Rif1 promotes association of G-quadruplex (G4) by its specific G4 binding and oligomerization activities (2019)
  • Author(s): Masai Hisao、Fukatsu Rino、Kakusho Naoko、Kanoh Yutaka、Moriyama Kenji、Ma Yue、Iida Keisuke、Nagasawa Kazuo
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 9 Issue: 1 Pages: 8618-8618
  • DOI: 10.1038/s41598-019-44736-9
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Cdc7 kinase stimulates Aurora B kinase in M-phase (2019)
  • Author(s): Ito Sayuri、Goto Hidemasa、Kuniyasu Kinue、Shindo Mayumi、Yamada Masayuki、Tanaka Kozo、Toh Gaik-Theng、Sawa Masaaki、Inagaki Masaki、Bartek Jiri、Masai Hisao
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 9 Issue: 1 Pages: 18622-18622
  • DOI: 10.1038/s41598-019-54738-2
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Cdc7 activates replication checkpoint by phosphorylating the Chk1-binding domain of Claspin in human cells (2019)
  • Author(s): Yang Chi-Chun、Kato Hiroyuki、Shindo Mayumi、Masai Hisao
  • Journal Title: eLife Volume: 8
  • DOI: 10.7554/elife.50796
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Claspin, a key regulator of replication checkpoint, is differentially regulated in cancer and non-cancer cells. (2020)
  • Author(s): Chi-Chun Yang、Hisao Masai
  • Organizer: 11th international symposium on DNA Damage Response & Human Disease
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] グアニン４重鎖/RNA-DNAハイブリッド構造によるDNA複製の制御機構 (2020)
  • Author(s): 正井久雄
  • Organizer: 第93回日本生化学会大会 シンポジウム『ゲノム反応中間体としての非B型核酸:その構造と生物学的意義』
  • Invited
• [Presentation] G4/RNA-DNAハイブリッドに依存する環状染色体DNAの複製機構 (2020)
  • Author(s): 正井 久雄 、 田中 卓 、鷺 朋子 、深津 理乃 、関 由美香
  • Organizer: 第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020 ワークショップ 『核様体DNAの複製と品質維持の最前線研究』
  • Invited
• [Presentation] Cdc7ーASKキナーゼ複合体の脳の発生における役割 (2020)
  • Author(s): 堀 かりん、 井口 智弘、山崎 聡志、小野 富男、丸山 千秋、正井 久雄
  • Organizer: 第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
• [Presentation] 転写によるRNA-DNAハイブリッド上でのG４構造形成 (2020)
  • Author(s): 井上 直也 、覺正 直子 、正井 久雄
  • Organizer: 第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
• [Presentation] 細胞融合によるPD-L1の発現上昇は腫瘍形成を促進する (2020)
  • Author(s): 田島 陽一 、 芝崎 太 、正井 久雄
  • Organizer: 第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
• [Presentation] 免疫細胞の増殖と分化におけるCdc7と活性化サブユニットASK(Dbf4)の役割 (2020)
  • Author(s): 井口 智弘、 山崎 聡志、小野 富男、石井 里絵、堀 かりん、小林 駿介、正井 久雄
  • Organizer: 第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
• [Presentation] multi-replicon 様式の大腸菌染色体複製メカニズム (2020)
  • Author(s): 田中 卓、 鷺 朋子、西藤 泰昌、正井 久雄
  • Organizer: 第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
• [Presentation] Rif1多量体形成能の複製タイミング制御における役割の解明 (2020)
  • Author(s): 高沢 佳芳、 加納 豊、松本 清治、小林 駿介、深津 理乃、覺正 直子、正井 久雄
  • Organizer: 第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
• [Presentation] RNA-DNAハイブリッド/G4構造に依存する大腸菌plasmidの複製開始メカニズムの解析 (2020)
  • Author(s): 深津 理乃 、 田中 卓 、正井 久雄
  • Organizer: 第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
• [Presentation] リン酸化によるClaspinの分子内相互作用によるDNA複製の制御 (2020)
  • Author(s): YOU Zhiying 、 YANG ChiChun 、正井 久雄
  • Organizer: 第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
• [Presentation] 分裂酵母のRif1の過剰発現は増殖を阻害し、M期の進行を妨害することで細胞死を誘導する (2020)
  • Author(s): 加納 豊、 松本 清治、上野 勝、正井 久雄
  • Organizer: 第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
• [Presentation] 大腸菌におけるゲノム上のRNA-DNA hybrid・グアニン4重鎖構造のプロファイルと第二の複製系での役割の解明 (2020)
  • Author(s): 鷺 朋子、 田中 卓、正井 久雄
  • Organizer: 第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
• [Presentation] ClaspinはPI3 kinaseとmTORと相互作用し、血清飢餓からの増殖と栄養系シグナル伝達に必要である (2020)
  • Author(s): 楊 其駿 、 正井 久雄
  • Organizer: 第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
• [Presentation] ヒトRif1C末領域はその核膜局在と複製タイミング制御に必要とされる (2020)
  • Author(s): 伊藤 さゆり、 井口 智弘、覺正 直子、大字 亜沙美、平谷 伊智朗、正井 久雄
  • Organizer: 第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
• [Presentation] Molecular Insights into Claspin-Mediated Skew of CD4+ T Cell Differentiation and Its Response to Replication Stress. (2020)
  • Author(s): HSIAO Hao-Wen、 IGUCHI Tomohiro、MASAI Hisao
  • Organizer: 第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
• [Presentation] Association of Rif1 with nuclear membrane is essential for genome-wide replication timing regulation (2019)
  • Author(s): Hisao Masai, Yutaka Kanoh, Rino Fukatsu, Seiji Matsumoto, Shunsuke Kobayashi, Hiroyuki Kato, Asami Oji, Sayuri Ito, Naoko Kakusho, Kenji Moriyama, Ichiro Hiratani, Naoko Yoshizawa.
  • Organizer: Cold Spring Harbor Laboratory Meeting EUKARYOTIC DNA REPLICATION& GENOME MAINTENANCE
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Biochemical and genetic dissection of Rif1 protein which regulates replication timing through binding to G-quadruplex (2019)
  • Author(s): Masai, H., Kanoh, Y., Matsumoto, S., Fukatsu, R., Kobayashi, S., Kakusho, N.,Sekiguchi, N., Takasawa, K.
  • Organizer: EMBO Workshop on Fission Yeast/ The 10th International Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Neural stem cell- or hematopoietic stem cell-specific knockout of Cdc7 or ASK(Dbf4) exhibits common and distinct phenotypes. (2019)
  • Author(s): Tomohiro Iguchi, Shunsuke Kobayashi, Karin Hori, Satoshi Yamazaki, Tomio Ono, Chiaki Maruyama, Hisao Masai.
  • Organizer: Cold Spring Harbor Laboratory Meeting EUKARYOTIC DNA REPLICATION& GENOME MAINTENANCE
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Genetic analyses of Rif1 protein and G-quadruplexes on the fission yeast genome. (2019)
  • Author(s): Kanoh, Y., Kobayashi, S., Fukatsu, R., Kakusho, N., Matsumoto, S., Takawasa. K.,Masai, H.
  • Organizer: EMBO Workshop on Fission Yeast/ The 10th International Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] DNA複製の正と負の制御に関わるグアニン４重鎖構造（In search of a universal mode of DNA replication） (2019)
  • Author(s): 正井 久雄、加納 豊、田中 卓、吉沢 直子、伊藤 さゆり、森山 賢治、加藤 宏幸、井口 智弘、松本 清治、Zhiying You、深津 理乃、覺正 直子、鷺 朋子、小林 駿介、楊 基駿、堀 かりん、高沢 佳芳、富樫 育子、上野 勝、長澤 和夫、Yue Ma
  • Organizer: 第42回 日本分子生物学会年会
  • Invited
• [Presentation] 新しいゲノムシグナチャーとしてのRNA-DNA ハイブリッドとグアニン４重鎖 (2019)
  • Author(s): 正井久雄、加納豊、田中卓、伊藤さゆり、深津理乃、森山賢治、鷺朋子、覺正直子、吉沢直子、井口智成、加藤宏幸
  • Organizer: 第92回日本生化学会大会
  • Invited
• [Remarks] ゲノム動態プロジェクト
  • URL: https://www.igakuken.or.jp/genome/
• [Remarks] ゲノム動態プロジェクト
  • URL: http://www.igakuken.or.jp/genome/