Efficient Chemical Synthesis of Polyubiquitin and Ubiquitinated Proteins

• Project Area: New frontier for ubiquitin biology driven by chemo-technologies
• Project/Area Number: 19H05287
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 林 剛介 名古屋大学, 工学研究科, 准教授 (40648268)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2021-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000); Fiscal Year 2020: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000); Fiscal Year 2019: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
• Keywords: 人工抗体 / タンパク質化学合成 / ペプチド化学 / 進化分子工学 / タンパク質標識化 / ユビキチンプロテオミクス / in vitroセレクション

Outline of Research at the Start

本研究では、タンパク質を化学的に作成する「タンパク質化学合成」の技術を用いてこれまで作れなかった複雑なポリユビキチン鎖およびユビキチン化タンパク質の化学合成を可能にする新手法を開発します。また、化学合成されたユビキチン鎖に特異的に結合する分子を進化分子工学の方法を用いて創製することにより、未だに明らかになっていない多様なユビキチン鎖が生命機能に与える影響の全容解明に寄与します。

Outline of Annual Research Achievements

（１）プロテアソーム関連因子RPN10に結合する人工抗体の開発と応用、（２）ユビキチン化リボソームに結合する人工抗体の取得と応用、（３）ユビキチン化タンパク質の化学合成と構造解析への応用研究、という4テーマについて研究を推進した。
テーマ（１）について：我々の研究グループの独自技術であるTRAPディスプレイ法を用いてRPN10の3つの異なるドメイン（UIM1、UIM2、RAZUL）に対して選択的に阻害することが可能な人工抗体の取得を目指して研究を推進した。3つのドメインそれぞれに対してTRAPディスプレイ法を用いて人工抗体をスクリーニングした結果、UIM1に選択的に結合するFynomer、RAZULドメインに選択的に結合するMonobodyの取得に成功した。RAZUL結合Monobodyに関しては、RAZUL-AZUL間のタンパク質間相互作用を競合的に阻害可能であることが明らかとなった。これらの人工抗体は、共同研究先において細胞内で発現させ、その機能解析を進めている。
テーマ（２）について：ペプチド合成およびペプチドライゲーション技術を駆使し、ユビキチン化されたリボソームタンパク質の部分ペプチドをまず化学的に合成した。今後、TRAPディスプレイ法を用いて人工抗体の取得を試みる予定である。
テーマ（３）について：エピジェネティクス分野で重要な「維持メチル化」機構に深く関わるジユビキチン化されたPAF15タンパク質の化学合成を行った。具体的には、5つのペプチド断片をFmoc固相合成法によって作製した後、N末端側のペプチド断片から順次連結させ、途中に脱硫反応（Cys-Ala変換反応）を経て、ジユビキチン化された全長PAF15の合成に成功した。ただし、合成量は低く、HPLC精製によって除くことのできない不純物が一定量混入していたため、合成ルートを改善して再合成を行う予定である。

Research Progress Status

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Organoruthenium-Catalyzed Chemical Protein Synthesis to Elucidate the Functions of Epigenetic Modifications on Heterochromatin Factors (2021)
  • Author(s): Kamo, N.; Kujirai, T.; Kurumizaka, H.; Murakami, H.; Hayashi, G.; Okamoto, A.
  • Journal Title: Chem. Sci. Volume: 12 Issue: 16 Pages: 5926-5937
  • DOI: 10.1039/d1sc00731a
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] cDNA TRAP display for rapid and stable in vitro selection of antibody-like proteins (2021)
  • Author(s): Kondo Taishi、Eguchi Minori、Kito Seita、Fujino Tomoshige、Hayashi Gosuke、Murakami Hiroshi
  • Journal Title: Chemical Communications Volume: 57 Issue: 19 Pages: 2416-2419
  • DOI: 10.1039/d0cc07541h
  • NAID: 120007169556
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Novel Strategies of Peptide Ligation for Accelerating Chemical Protein Synthesis (2020)
  • Author(s): Hayashi Gosuke、Okamoto Akimitsu
  • Journal Title: Journal of Synthetic Organic Chemistry, Japan Volume: 78 Issue: 2 Pages: 130-139
  • DOI: 10.5059/yukigoseikyokaishi.78.130
  • NAID: 130007795912
  • ISSN: 0037-9980, 1883-6526
  • Year and Date: 2020-02-01
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Acetylation-modulated communication between the H3 N-terminal tail domain and the intrinsically disordered H1 C-terminal domain (2020)
  • Author(s): Hao, F; Murphy, K. J.; Kujirai, T.; Kamo, N.; Kato, J.; Koyama, M.; Okamato, A.; Hayashi, G.; Kurumizaka, H.; Hayes, J. J.
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. Volume: 48 Issue: 20 Pages: 11510-11520
  • DOI: 10.1093/nar/gkaa949
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] L-DNA-tagged fluorescence in situ hybridization for highly sensitive imaging of RNAs in single cells (2020)
  • Author(s): Ogata, M.; Hayashi, G.; Ichiu, A.; Okamoto, A.
  • Journal Title: Org. Biomol. Chem. Volume: 18 Issue: 40 Pages: 8084-8088
  • DOI: 10.1039/d0ob01635g
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Antibody-like proteins that capture and neutralize SARS-CoV-2 (2020)
  • Author(s): Kondo T.、Iwatani Y.、Matsuoka K.、Fujino T.、Umemoto S.、Yokomaku Y.、Ishizaki K.、Kito S.、Sezaki T.、Hayashi G.、Murakami H.
  • Journal Title: Science Advances Volume: 6 Issue: 42 Pages: 3916-3916
  • DOI: 10.1126/sciadv.abd3916
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Fmoc-Compatible and C-terminal-Sequence-Independent Peptide Alkyl Thioester Formation Using Cysteinylprolyl Imide (2020)
  • Author(s): Nakatsu, K.; Yanase, M.; Hayashi, G.; Okamoto, A.
  • Journal Title: Org. Lett. Volume: 22 Issue: 12 Pages: 4670-4674
  • DOI: 10.1021/acs.orglett.0c01450
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Toolbox for chemically synthesized histone proteins (2020)
  • Author(s): Nakatsu, K.; Hayashi, G.; Okamoto, A.
  • Journal Title: Curr. Opin. Chem. Biol. Volume: 58 Pages: 10-19
  • DOI: 10.1016/j.cbpa.2020.04.016
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] タンパク質化学合成を活用した翻訳後修飾研究 (2020)
  • Author(s): 林 剛介
  • Journal Title: Farumashia Volume: 56 Issue: 1 Pages: 46-50
  • DOI: 10.14894/faruawpsj.56.1_46
  • NAID: 130007779027
  • ISSN: 0014-8601, 2189-7026
• [Journal Article] Cysteinylprolyl imide (CPI) peptide: a highly reactive and easily accessible crypto-thioester for chemical protein synthesis (2019)
  • Author(s): Yanase Masafumi、Nakatsu Koki、Cardos Charlane Joy、Konda Yoshiki、Hayashi Gosuke、Okamoto Akimitsu
  • Journal Title: Chemical Science Volume: 10 Issue: 23 Pages: 5967-5975
  • DOI: 10.1039/c9sc00646j
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Chemical Synthesis of Cys-Containing Protein via Chemoselective Deprotection with Different Palladium Complexes (2019)
  • Author(s): Kamo, N.; Hayashi, G.; Okamoto, A.
  • Journal Title: Org. Lett. Volume: 21 Issue: 20 Pages: 8378-8382
  • DOI: 10.1021/acs.orglett.9b03152
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] 修飾ヒストンの効率的化学合成法とヒストン動態解析 (2021)
  • Author(s): 林剛介
  • Organizer: 第14回日本エピジェネティクス研究会年会
• [Presentation] タンパク質化学合成技術を駆使した修飾タンパク質の創製と生化学研究への展開 (2020)
  • Author(s): 林剛介
  • Organizer: 第93回日本生化学会大会
  • Invited
• [Presentation] Challenges and prospects in chemoselective ligations: from protein synthesis to site-specific conjugation (2020)
  • Author(s): Gosuke Hayashi
  • Organizer: LE STUDIUM CONFERENCES
• [Presentation] Novel Peptide Ligation Strategies for Chemical Protein Synthesis (2020)
  • Author(s): Gosuke Hayashi
  • Organizer: Seminar at University of Paris
  • Invited
• [Presentation] Chemical Protein Synthesis with Novel Ligation Strategies (2020)
  • Author(s): Gosuke Hayashi
  • Organizer: Seminar at CBM, CNRS Orleans Campus
  • Invited
• [Presentation] 修飾タンパク質作製を可能にする最先端技術 ～生合成 vs 化学合成～ (2020)
  • Author(s): 林 剛介
  • Organizer: 第568回東北大学薬学研究科セミナー
  • Invited
• [Presentation] Novel technologies for studying chromatin modifications (2019)
  • Author(s): Gosuke Hayashi
  • Organizer: 42nd MBSJ
  • Invited
• [Book] 生体分子反応を制御する 化学的手法による機構と反応場の解明 「エピジェネティック修飾の謎を解き明かす核酸およびタンパク質化学」 (2020)
  • Author(s): 林剛介、岡本晃充
  • Total Pages: 193
  • Publisher: 化学同人
• [Patent(Industrial Property Rights)] 62.フィブロネクチンIII型ドメイン骨格を含むポリペプチド (2020)
  • Inventor(s): 村上裕、都築成晃、近藤大志、林剛介、藤野公茂、築地真也、吉井達之
  • Industrial Property Rights Holder: 村上裕、都築成晃、近藤大志、林剛介、藤野公茂、築地真也、吉井達之
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2020
• [Patent(Industrial Property Rights)] 63.SARS-CoV-2 Binding Molecule (2020)
  • Inventor(s): 村上裕、近藤大志、藤野公茂、林剛介、梅本駿、岩谷靖雅
  • Industrial Property Rights Holder: 村上裕、近藤大志、藤野公茂、林剛介、梅本駿、岩谷靖雅
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2020
  • Overseas