Development of small chemical compounds that specifically inhibit USP-family deubiquitinating enzymes.

• Project Area: New frontier for ubiquitin biology driven by chemo-technologies
• Project/Area Number: 19H05292
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 高橋 宏隆 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 准教授 (70432804)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2021-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥8,060,000 (Direct Cost: ¥6,200,000、Indirect Cost: ¥1,860,000); Fiscal Year 2020: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2019: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
• Keywords: 脱ユビキチン化酵素 / USPファミリー / DUB阻害剤 / タンパク質アレイ / コムギ無細胞タンパク質合成系 / 低分子化合物阻害剤 / 脱ユビキチン化酵素タンパク質アレイ / コムギ無細胞系 / ユビキチン

Outline of Research at the Start

疾患や生物学的重要性が既に報告されているUSP14, USP15, CYLDの３種のUSPファミリーの脱ユビキチン化酵素（DUB）を解析対象とし、先行研究で得られたDUB阻害剤について、上記３つのDUBにより高い特異性を示す化合物をIn silico解析によりデザインし、それらの誘導体を有機合成する。得られた誘導体をもとに、申請者独自の DUBパネルを用いた化合物の生化学的評価、および細胞レベルでの解析により特異的阻害剤の開発を進め、種々の阻害剤を用いて上記3種のUSPに対するシグナル伝達および疾患機構の解明を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

申請者は、脱ユビキチン化酵素（DUB)の中でUSPファミリーに属するDUBのみを特異的に阻害する低分子化合物Subquinocinを取得している。そこで本研究では炎症・免疫応答やタンパク質分解に重要な役割を担うUSP14, USP15, CYLDの3種のUSPを解析対象として、Subquinocinの構造展開により、それぞれのUSPに高い特異性を示す低分子化合物の開発を行った。
前年度に研究協力者の理化学研究所の本間 光貴先生との共同研究により、東京大学創薬機構が保有する化合物の中からSubquinocinと類似構造を持つ化合物を320種類選抜した。この320種類の化合物について、既に化合物の評価系が構築されているCYLDとUSP15への阻害効果を調べた結果、阻害活性が非常に高い化合物を２種見出し、UI1, UI2と命名した。SubquinocinのCYLDおよびUSP15への阻害率は10マイクロMでそれぞれ10％、30％だったが、UI1は同濃度でUSP15とCYLDの双方をほぼ100％阻害し、UI2はUSP15を80％阻害する結果だった。さらにこれらの化合物のUSPに対する特異性についてDUBパネルを用いて調べたところ、どちらも複数のUSPを阻害するものの、UI1はUSP15の他にUSP11など限られたUSPのみを阻害することが分かった。さらに、培養細胞を用いてこれらの化合物の効果を評価した。USP15はRIG-I依存的なNF-kB経路活性化を亢進することが報告されているが、UI1、UI2のどちらの化合物もRIG-IによるNF-kB活性化を亢進する結果が得られ、これらの化合物は細胞内のUSP15を阻害している可能性が示唆された。
またDUB阻害剤の選択性を調べるDUBパネルについても、10種類以上のDUBを追加し、より幅広いDUBで化合物の特異性を評価することが可能となった。

Research Progress Status

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Thalidomide and its metabolite 5‐hydroxythalidomide induce teratogenicity via the cereblon neosubstrate PLZF (2021)
  • Author(s): Yamanaka Satoshi、Murai Hidetaka、Saito Daisuke、Abe Gembu、Tokunaga Etsuko、Iwasaki Takahiro、Takahashi Hirotaka、Takeda Hiroyuki、Suzuki Takayuki、Shibata Norio、Tamura Koji、Sawasaki Tatsuya
  • Journal Title: The EMBO Journal Volume: 40 Issue: 4 Pages: 1-1
  • DOI: 10.15252/embj.2020105375
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] MIND bomb 2 prevents RIPK1 kinase activity-dependent and -independent apoptosis through ubiquitylation of cFLIPL (2021)
  • Author(s): Nakabayashi Osamu、Takahashi Hirotaka、Moriwaki Kenta、Komazawa-Sakon Sachiko、Ohtake Fumiaki、Murai Shin、Tsuchiya Yuichi、Koyahara Yuki、Saeki Yasushi、Yoshida Yukiko、Yamazaki Soh、Tokunaga Fuminori、Sawasaki Tatsuya、Nakano Hiroyasu
  • Journal Title: Communications Biology Volume: 4 Issue: 1 Pages: 80-80
  • DOI: 10.1038/s42003-020-01603-y
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Development and application of a protein array of human deubiquitinating enzyme (2020)
  • Author(s): 高橋宏隆、山中聡士、徳永文稔、澤崎達也
  • Journal Title: 生化学 Volume: 92 Issue: 1 Pages: 64-74
  • DOI: 10.14952/SEIKAGAKU.2020.920064
  • ISSN: 0037-1017
  • Year and Date: 2020-02-25
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A Human DUB Protein Array for Clarification of Linkage Specificity of Polyubiquitin Chain and Application to Evaluation of Its Inhibitors (2020)
  • Author(s): Takahashi Hirotaka、Yamanaka Satoshi、Kuwada Shohei、Higaki Kana、Kido Kohki、Sato Yusuke、Fukai Shuya、Tokunaga Fuminori、Sawasaki Tatsuya
  • Journal Title: Biomedicines Volume: 8 Issue: 6 Pages: 152-152
  • DOI: 10.3390/biomedicines8060152
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] コムギ無細胞合成系による脱ユビキチン化酵素アレイの作製とDUB阻害剤開発への応用 (2020)
  • Author(s): 高橋 宏隆、山中 聡士
  • Journal Title: ファルマシア Volume: 56 Pages: 51-55
  • NAID: 130007779025
• [Journal Article] Subquinocin, a small molecule inhibitor of CYLD and USP-family deubiquitinating enzymes, promotes NF-κB signaling (2020)
  • Author(s): Yamanaka Satoshi、Sato Yusuke、Oikawa Daisuke、Goto Eiji、Fukai Shuya、Tokunaga Fuminori、Takahashi Hirotaka、Sawasaki Tatsuya
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: 524 Issue: 1 Pages: 1-7
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2019.12.049
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Pyrrothiogatain acts as an inhibitor of GATA family proteins and inhibits Th2 cell differentiation in vitro (2019)
  • Author(s): Nomura Shunsuke、Takahashi Hirotaka、Suzuki Junpei、Kuwahara Makoto、Yamashita Masakatsu、Sawasaki Tatsuya
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 9 Issue: 1 Pages: 17335-17335
  • DOI: 10.1038/s41598-019-53856-1
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The E3 ubiquitin ligase MIB2 enhances inflammation by degrading the deubiquitinating enzyme CYLD (2019)
  • Author(s): Uematsu Atsushi、Kido Kohki、Takahashi Hirotaka、Takahashi Chikako、Yanagihara Yuta、Saeki Noritaka、Yoshida Shuhei、Maekawa Masashi、Honda Mamoru、Kai Tsutomu、Shimizu Kouhei、Higashiyama Shigeki、Imai Yuuki、Tokunaga Fuminori、Sawasaki Tatsuya
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 294 Issue: 38 Pages: 14135-14148
  • DOI: 10.1074/jbc.ra119.010119
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] USPファミリーの脱ユビキチン化酵素を特異的に阻害する低分子化合物の開発。 (2020)
  • Author(s): 高橋 宏隆，山中 聡士，桒田 翔平，檜垣 佳奈，佐藤 裕介，深井 周也，徳永 文稔，澤崎 達也。
  • Organizer: 第93回生化学会。シンポジウム「ケモテクノロジーが拓くユビキチンニューフロンティア」
  • Invited
• [Presentation] コムギ無細胞タンパク質アレイ技術を用いたユビキチンシグナル解析 (2020)
  • Author(s): 高橋 宏隆
  • Organizer: 第6回日本血管生物学会若手研究会
• [Presentation] コムギ無細胞系を用いた直鎖状ユビキチン鎖の新規デコーダー分子の網羅的探索と機能解析 (2020)
  • Author(s): 高橋 宏隆, 長尾 和哉, 岩崎 誠, 佐藤 裕介，及川 大輔, 徳永 文稔, 澤崎 達也
  • Organizer: 第43回 日本分子生物学会年会 ワークショップ「多彩な生理機能を発揮するユビキチンコードのバイオロジー」
• [Presentation] Biochemical analysis of DENV non-structural proteins using a wheat cell-free protein synthesis system. (2019)
  • Author(s): Takahashi H.
  • Organizer: 5th Peptides and Proteins Symposium Singapore (P2S2-2019)
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Establishment of a protein array system consisted of 90 human recombinant deubiquitinating enzymes (DUBs) proteins for assessment of linkage specificity of each DUB and evaluation of the selectivity of DUB inhibitors. (2019)
  • Author(s): Takahashi H, Kuwada S, Yamanaka S, Goto E, Tokunaga F, Sawasaki T.
  • Organizer: EMBO meeting. The ubiquitin system: Biology, mechanisms and roles in disease.
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 直鎖状ポリユビキチン鎖結合タンパク質ZnUBPファミリーのNF-kB抑制機構の解明 (2019)
  • Author(s): 高橋 宏隆, 及川 大輔, 長尾 和哉, 岩崎 誠, 今井 祐記, 徳永 文稔, 澤崎 達也
  • Organizer: 第42回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] ウイルスRNA受容体MDA5に結合し、IFN産生シグナルを抑制する脱ユビキチン化酵素の同定と機能解析 (2019)
  • Author(s): 高橋 宏隆，林 徳宙，竹田 浩之，入江 崇，澤崎 達也
  • Organizer: 第14回 日本臨床ストレス応答学会大会
• [Presentation] コムギ無細胞タンパク質合成系を基盤としたヒト脱ユビキチン化酵素タンパク質アレイの作製と応用。 (2019)
  • Author(s): 高橋 宏隆，山中 聡士，後藤 栄治，及川 大輔，佐藤 裕介，深井 周也，徳永 文稔，澤崎 達也
  • Organizer: 第24回 日本病態プロテアーゼ学会学術集会