Construction of synthetic nanopore by de novo design

• Project Area: Molecular Engine: Design of Autonomous Functions through Energy Conversion
• Project/Area Number: 19H05382
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology
• Principal Investigator: 川野 竜司 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (90401702)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2021-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000); Fiscal Year 2020: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000); Fiscal Year 2019: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
• Keywords: De novo設計 / ナノポア / 脂質二分子膜 / マイクロ流体デバイス / 電気生理 / de novo設計 / 膜ペプチド / マイクロデバイス

Outline of Research at the Start

本研究ではde novo設計によりβシート構造の短鎖ペプチドが脂質二分子膜の中で自己集合し、ナノポアを形成するという予備検討で得られた知見を元に、任意の機能を持つナノポア/チャネルを化学合成的手法により構築する。

Outline of Annual Research Achievements

タンパク質のfolding/unfoldingの理解は生命科学の最も重要なトピックスの一つである。ポリアミノ酸であるタンパク質の機能は、そのアミノ酸配列に起因する立体構造によってほぼ決定される。タンパク質の最終的な三次元構造は二次構造であるα-helixやβ-sheetがループでつながり三次元的に配置されたものであるため、アミノ酸の一次配列だけでなくこの二次構造の配置を理解することが重要である。De novo設計はアミノ酸の一次配列を人工的に設計することで最終的な三次元のfolding構造を作る事を目指した設計である。近年では、計算機を用いてアミノ酸の二面角や各種相互作用を詳細に計算することができるようになってきた。膜タンパク質に関してもde novo設計への挑戦が続いていたが、アミノ酸配列のみならず脂質分子との相互作用、疎水性の膜内部と親水性の膜外部のバランスが難しいという課題があった。2020年ワシントン大のBakerらはα-helixの膜貫通部分を有する膜タンパク質のde novo設計と合成に成功したが膜への再構成に課題が残った。本研究では我々も短鎖のペプチドをde novo設計することにより脂質膜に効率よくチャネルを形成するナノポアタンパクの設計に成功した（投稿中）。また領域内共同研究として、バクテリオファージのナノニードルが脂質膜とどのように相互作用するかに関し、人工膜系でこのメカニズムの解明に取り組んだ。上野GはナノニードルのMDシミュレーション、QCMを用いた測定、内橋Gは高速AFMを用いて貫通する際のダイナミクスの観測、申請者はナノニードルが貫通時の電気生理計測と解析から、そのダイナミクスの解明を試みた。その結果、ナノニードルはその先端を特定の角度で脂質膜に突き刺し、膜電位に従って膜を貫通することが明らかとなった。これらの成果をNanoscale誌に発表した。

Research Progress Status

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Department of Chemistry/Univerisity of Cincinnati(米国)
• [Int'l Joint Research] National University of Mongolia(モンゴル)
• [Journal Article] Dynamic behavior of an artificial protein needle contacting a membrane observed by high-speed atomic force microscopy (2020)
  • Author(s): Ueno Takafumi、Niwase Kento、Tsubokawa Daisho、Kikuchi Kosuke、Takai Natsumi、Furuta Tadaomi、Kawano Ryuji、Uchihashi Takayuki
  • Journal Title: Nanoscale Volume: in press Issue: 15 Pages: 8166-8173
  • DOI: 10.1039/d0nr01121e
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Recessed Ag/AgCl Microelectrode-Supported Lipid Bilayer for Nanopore Sensing (2020)
  • Author(s): Shoji Kan、Kawano Ryuji、White Ryan J.
  • Journal Title: Analytical Chemistry Volume: 92 Issue: 15 Pages: 10856-10862
  • DOI: 10.1021/acs.analchem.0c02720
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Analysis of Membrane Protein Deinsertion-Associated Currents with Nanoneedle-Supported Bilayers to Discover Pore Formation Mechanisms (2020)
  • Author(s): Shoji Kan、Kawano Ryuji、White Ryan J.
  • Journal Title: Langmuir Volume: 36 Issue: 34 Pages: 10012-10021
  • DOI: 10.1021/acs.langmuir.0c00833
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Analytical Model for Particle Capture in Nanopores Elucidates Competition among Electrophoresis, Electroosmosis, and Dielectrophoresis (2020)
  • Author(s): Chinappi Mauro、Yamaji Misa、Kawano Ryuji、Cecconi Fabio
  • Journal Title: ACS Nano Volume: 14 Issue: 11 Pages: 15816-15828
  • DOI: 10.1021/acsnano.0c06981
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] De Novo Design of a Nanopore for DNA Detection Incorporating a β-hairpin Peptide (2020)
  • Author(s): Shimizu Keisuke、Mijiddorj Batsaikhan、Yoshida Shuhei、Akayama Shiori、Hamada Yoshio、ohyama akifumi、Usui Kenji、Kawamura Izuru、Kawano Ryuji
  • Journal Title: ChemRxiv Volume: 1 Pages: 1-1
  • DOI: 10.26434/chemrxiv.12286337.v1
  • Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Electrophysiological Analysis of Antimicrobial Peptides in Diverse Species (2019)
  • Author(s): Saigo Naoki、Izumi Kayano、Kawano Ryuji
  • Journal Title: ACS Omega Volume: 4 Issue: 8 Pages: 13124-13130
  • DOI: 10.1021/acsomega.9b01033
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 「Nanopore decoding for DNA computing」(Keynote lecture) (2020)
  • Author(s): Ryuji Kawano
  • Organizer: Nanopore Electrochemistry Meeting (Online)
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Analysis of transmembrane peptides using a lipid bilayer system (2020)
  • Author(s): Ryuji Kawano
  • Organizer: 第58回 生物物理学会年会 (Online)
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] ボトムアップ配列設計ペプチドによるナノポアの構築 (2020)
  • Author(s): 川野竜司
  • Organizer: 第72回 日本生物工学会大会（Online）
  • Invited
• [Presentation] De Novo Design of Transmembrane Peptides Constructed in Artificial Cell Membrane System (2019)
  • Author(s): Ryuji Kawano
  • Organizer: Imperial Seminer2019
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Remarks] 東京農工大学 川野研究室
  • URL: http://web.tuat.ac.jp/~rjkawano/index.html
• [Remarks] 東京農工大学 川野研究室
  • URL: http://web.tuat.ac.jp/~rjkawano/index.html