線虫Ｃ．エレガンスにおける凝集タンパク質および分子夾雑場のX線１分子観察

• Project Area: Chemical Approaches for Miscellaneous / Crowding Live Systems
• Project/Area Number: 20H04696
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Ibaraki University (2021); The University of Tokyo (2020)
• Principal Investigator: 倉持 昌弘 茨城大学, 理工学研究科(工学野), 助教 (60805810)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2022-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000); Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2020: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: 線虫Ｃ．エレガンス / X線１分子計測 / 結晶性 / 蛍光タンパク質 / 細胞内夾雑場 / 結晶化タンパク質 / 過飽和

Outline of Research at the Start

X線１分子計測法と蛍光イメージングを駆使して、線虫C. エレガンスに遺伝子発現させたタンパク質分子動態、細胞内夾雑環境の計測を行い、タンパク質結晶化の物理プロセスを明らかにします。着目するタンパク質は、結晶性と蛍光性をもちます。そのため、無標識でタンパク質分子自身のX線回折像を取得でき、かつ蛍光観察が可能です。X線１分子計測によるタンパク質分子のナノスケール動態と、蛍光観察による結晶化プロセスという巨視的スケールの観察を行います。また、結晶性ナノ材料を細胞内に導入することで、細胞夾雑場のゆらぎ計測も実施し、結晶化に関連する細胞内夾雑場、分子自身の構造特異的な動的性質を明らかにします。

Outline of Annual Research Achievements

生体内における凝集・結晶化プロセスの動的性質を明らかにするため、結晶化タンパク質を対象として、タンパク質分子のX線動態計測、蛍光イメージングによる凝集状態観察、そして細胞内夾雑場のゆらぎ計測を実施し、夾雑環境場と凝集・結晶化の物理素過程の理解を目指した。
X線分子動態計測法は、標的タンパク質分子にナノ結晶を標識し、ナノ結晶由来のX線回折像を時分割取得することで、タンパク質分子の動きを捉えるユニークな計測法である。従来、タンパク質分子は、結晶性をもたないが、今回着目するタンパク質分子は細胞内で結晶化するため、タンパク質の動きを直接X線計測できる。これまで線虫サンプル系の作製、蛍光観察、およびタンパク質分子のX線分子動態計測を行った。その結果、線虫体内のタンパク質分子から、微弱ながらも分子由来の回折像を取得できた。一方、微弱信号から分子動態を捉えることは困難を極めたため、物性既知の無機材料を対象として、本計測法の検出限界改善に取り組んだ。試料最適化、X線測定用光学顕微鏡構築、新規の時分割解析法の考案など、ハード・ソフト両面の改良を行い、SN比の粗悪データからでも物性動態を評価できるようにした。これにより、線虫体内に形成された結晶動態の温度依存性を評価することができた。大型放射光施設SPring-8を利用した測定も実施し、線虫体内に形成された結晶分子は、結晶格子ゆらぎが主な運動成分であり、結晶成長と関連した動きである可能性が示唆された。これと並行して、タンパク質周囲の細胞夾雑環境の測定技術開発にも取り組んだ。さらに、結晶をキーワードとして、細胞や個体生物の凍結保存に着目し、本計測を適用した。生体内部で氷晶が成長していく瞬間を捉えることができ、結晶がどのように生体内で構築・蓄積されていくのか、その過程や動的構造の基礎知見を深めることができた。

Research Progress Status

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Dynamic motions of ice-binding proteins in living Caenorhabditis elegans using diffracted X-ray blinking and tracking (2022)
  • Author(s): Kuramochi Masahiro、Dong Yige、Yang Yue、Arai Tatsuya、Okada Rio、Shinkai Yoichi、Doi Motomichi、Aoyama Kouki、Sekiguchi Hiroshi、Mio Kazuhiro、Tsuda Sakae、Sasaki Yuji C.
  • Journal Title: Biochemistry and Biophysics Reports Volume: 29 Pages: 101224-101224
  • DOI: 10.1016/j.bbrep.2022.101224
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Diffracted X-ray Tracking Method for Measuring Intramolecular Dynamics of Membrane Proteins (2022)
  • Author(s): Fujimura Shoko、Mio Kazuhiro、Ohkubo Tatsunari、Arai Tatsuya、Kuramochi Masahiro、Sekiguchi Hiroshi、Sasaki Yuji C.
  • Journal Title: International Journal of Molecular Sciences Volume: 23 Issue: 4 Pages: 2343-2343
  • DOI: 10.3390/ijms23042343
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Superelasticity of a photo-actuating chiral salicylideneamine crystal (2022)
  • Author(s): Taniguchi Takuya、Ishizaki Kazuki、Takagi Daisuke、Nishimura Kazuki、Shigemune Hiroki、Kuramochi Masahiro、Sasaki Yuji C.、Koshima Hideko、Asahi Toru
  • Journal Title: Communications Chemistry Volume: 5 Issue: 1 Pages: 4-4
  • DOI: 10.1038/s42004-021-00618-8
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] New Family Members of FG Repeat Proteins and Their Unexplored Roles During Phase Separation (2021)
  • Author(s): Shinkai Yoichi、Kuramochi Masahiro、Miyafusa Takamitsu
  • Journal Title: Frontiers in Cell and Developmental Biology Volume: 9
  • DOI: 10.3389/fcell.2021.708702
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Laboratory diffracted x-ray blinking to monitor picometer motions of protein molecules and application to crystalline materials (2021)
  • Author(s): Arai Tatsuya、Inamasu Rena、Yamaguchi Hiroki、Sasaki Daisuke、Sato-Tomita Ayana、Sekiguchi Hiroshi、Mio Kazuhiro、Tsuda Sakae、Kuramochi Masahiro、Sasaki Yuji C.
  • Journal Title: Structural Dynamics Volume: 8 Issue: 4 Pages: 044302-044302
  • DOI: 10.1063/4.0000112
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Living-Cell Diffracted X-ray Tracking Analysis Confirmed Internal Salt Bridge Is Critical for Ligand-Induced Twisting Motion of Serotonin Receptors (2021)
  • Author(s): Mio Kazuhiro、Fujimura Shoko、Ishihara Masaki、Kuramochi Masahiro、Sekiguchi Hiroshi、Kubo Tai、Sasaki Yuji C.
  • Journal Title: International Journal of Molecular Sciences Volume: 22 Issue: 10 Pages: 5285-5285
  • DOI: 10.3390/ijms22105285
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Structural basis for the coiled-coil architecture of human CtIP (2021)
  • Author(s): Morton C. R.、Rzechorzek N. J.、Maman J. D.、Kuramochi M.、Sekiguchi H.、Rambo R.、Sasaki Y. C.、Davies O. R.、Pellegrini L.
  • Journal Title: Open Biology Volume: 11 Issue: 6 Pages: 210060-210060
  • DOI: 10.1098/rsob.210060
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] X線1分子追跡法を用いたTRPイオンチャネル運動の高速時分割計測と制御機構の理解 (2021)
  • Author(s): 三尾 和弘、藤村 章子、倉持 昌弘、関口 博史、佐々木 裕次
  • Journal Title: 日本放射光学会誌 Volume: 34 Pages: 258-266
  • NAID: 40022720878
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Tilting and rotational motions of silver halide crystal with diffracted X-ray blinking (2021)
  • Author(s): Kuramochi Masahiro、Omata Hiroki、Ishihara Masaki、Hanslin Sander ?.、Mizumaki Masaichiro、Kawamura Naomi、Osawa Hitoshi、Suzuki Motohiro、Mio Kazuhiro、Sekiguchi Hiroshi、Sasaki Yuji C.
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 11 Issue: 1 Pages: 4097-4097
  • DOI: 10.1038/s41598-021-83320-y
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Diffracted X-ray blinking measurements of interleukin 15 receptors in the inner/outer membrane of living NK cells (2021)
  • Author(s): Chang Jaewon、Baek Yonugseok、Lee Injee、Sekiguchi Hiroshi、Ichiyanagi Kouhei、Mio Kazuhiro、Nozawa Shunsuke、Fukaya Ryo、Adachi Shin-ichi、Kuramochi Masahiro、Sasaki Yuji C.
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: 556 Pages: 53-58
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2021.03.144
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 線虫の凍結・低温耐性を改善する氷結合タンパク質の生体内作用機序の解明 (2021)
  • Author(s): 倉持 昌弘、三尾 和弘、津田 栄、佐々木 裕次
  • Journal Title: 月刊「細胞」 Volume: 53 Pages: 66-69
  • NAID: 40022573722
• [Journal Article] 個体生物の凍結・低温耐性を改善する不凍タンパク質の生体内効果 (2021)
  • Author(s): 倉持 昌弘、三尾 和弘、津田 栄、佐々木 裕次
  • Journal Title: 月刊「アグリバイオ」 Volume: 5 Pages: 93-98
  • NAID: 40022590457
• [Journal Article] Agonist and Antagonist-Diverted Twisting Motions of a Single TRPV1 Channel (2020)
  • Author(s): Fujimura Shoko、Mio Kazuhiro、Kuramochi Masahiro、Sekiguchi Hiroshi、Ikezaki Keigo、Mio Muneyo、Hengphasatporn Kowit、Shigeta Yasuteru、Kubo Tai、Sasaki Yuji C.
  • Journal Title: The Journal of Physical Chemistry B Volume: 124 Issue: 51 Pages: 11617-11624
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.0c08250
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] X-ray-based living-cell motion analysis of individual serotonin receptors (2020)
  • Author(s): Mio Kazuhiro、Ishihara Masaki、Fujimura Shoko、Sasaki Daisuke、Nozawa Shunsuke、Ichiyanagi Kohei、Fukaya Ryo、Adachi Shin-ichi、Kuramochi Masahiro、Sekiguchi Hiroshi、Kubo Tai、Sasaki Yuji C.
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: 529 Issue: 2 Pages: 306-313
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2020.05.200
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 線虫C. エレガンスにおける凝集タンパク質および分子夾雑場のX線1分子観察 (2022)
  • Author(s): 倉持昌弘
  • Organizer: 新学術領域研究「分子夾雑化学」第6回領域会議
• [Presentation] 回折X線ブリンキングによる結晶材料の動的構造解析 (2022)
  • Author(s): 倉持昌弘、引田理英、佐々木裕次
  • Organizer: 2021年度量子ビームサイエンスフェスタ
• [Presentation] 時分割回折X線ブリンキングによるソフトクリスタル動的特性観測 (2022)
  • Author(s): 倉持昌弘
  • Organizer: 新学術領域研究「ソフトクリスタル」第8回公開シンポジウム
• [Presentation] 線虫C. エレガンスにおける凝集タンパク質および分子夾雑場のX線1分子観察 (2021)
  • Author(s): 倉持昌弘
  • Organizer: 新学術領域研究「分子夾雑化学」第5回領域会議
• [Presentation] 時分割回折X線ブリンキングによるソフトクリスタル動的特性観測 (2021)
  • Author(s): 倉持昌弘
  • Organizer: 新学術領域研究「ソフトクリスタル」第7回公開シンポジウム
• [Presentation] Mechanism of in-cell protein crystallization with supersaturated environment and its application (2021)
  • Author(s): 倉持昌弘
  • Organizer: 線虫研究の未来を創る会
• [Presentation] X-ray avoidance behaviour in C. elegans (2021)
  • Author(s): 大津乃亜、倉持昌弘
  • Organizer: 線虫研究の未来を創る会
• [Presentation] Cryopreservation of C. elegans by ice-binding protein (2021)
  • Author(s): 下谷祐平、倉持昌弘
  • Organizer: 線虫研究の未来を創る会
• [Presentation] X線ブリンキング法による生物個体内の結晶化タンパク質および分子夾雑場観察 (2021)
  • Author(s): 倉持昌弘
  • Organizer: ３新学術領域合同シンポジウム
  • Invited
• [Presentation] 生きた細胞上の GPCR のミリ秒-マイクロ秒タイナミクスMilli- to microsecond dynamics of Single GPCR in Living Cells (2021)
  • Author(s): 藤村章子、石原正輝、一柳光平、野澤俊介、足立伸一、深谷亮、倉持昌弘、関口博史、三尾和弘、佐々木裕次
  • Organizer: 2020年度 量子ビームサイエンスフェスタ
• [Presentation] 回折X線フリンキンクによるタイヤコムの動的構造解析 Dynamic Structure Analysis for Tire Rubbers by Diffracted X-ray Blinking (2021)
  • Author(s): 倉持昌弘、増井友美、間下亮、引田理英、新井達也、 三尾和弘、関口博史、岸本浩通、佐々木裕次
  • Organizer: 2020年度 量子ビームサイエンスフェスタ
• [Presentation] 結晶性/非晶性 PEEK 高分子膜の時分割動態計測 Time-resolved observations of crystal / non-crystal PEEK film (2021)
  • Author(s): 下村峻矢、倉持昌弘、佐々木大輔、新井達也、 引田理英、佐々木裕次
  • Organizer: 2020年度 量子ビームサイエンスフェスタ
• [Presentation] DXB 法を用いた不凍タンハク質結晶の内部分子動態計測 Molecular motion of antifreeze protein in crystal measured by Diffracted X-ray Blinking (2021)
  • Author(s): 新井達也、倉持昌弘、三尾和弘、佐々木裕次
  • Organizer: 2020年度 量子ビームサイエンスフェスタ
• [Presentation] 固体高分子結晶性電解質内部のオヘラント分子動態計測 Operand-Measurement of molecular dynamics inside Solid Polymer Crystalline Electrolytes (2021)
  • Author(s): 佐々木大輔、橘川莉子、中山美沙恵、倉持昌弘、一柳光平、深谷亮、関口博史、佐藤文菜、野澤俊介、足立伸一、三尾和弘、 田所誠、佐々木裕次
  • Organizer: 2020年度 量子ビームサイエンスフェスタ
• [Presentation] 時分割回折X線ブリンキングによるソフトクリスタル動的特性観測 (2020)
  • Author(s): 倉持昌弘
  • Organizer: 新学術領域研究「ソフトクリスタル」第７回領域全体会議国内
• [Presentation] In vivo X-ray single-molecule observation of ice-binding proteins for Caenorhabditis elegans freezing tolerance (2020)
  • Author(s): M Kuramochi
  • Organizer: 第20回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] 線虫C. エレガンスにおける凝集タンパク質および分子夾雑場のX線1分子観察 (2020)
  • Author(s): 倉持昌弘
  • Organizer: 新学術領域研究「分子夾雑化学」第8回オンラインセミナー
• [Presentation] 時分割回折X線ブリンキングによるソフトクリスタル動的特性観測 (2020)
  • Author(s): 倉持昌弘
  • Organizer: 新学術領域研究「ソフトクリスタル」共同研究推進会議 2
• [Patent(Industrial Property Rights)] Ｘ線を用いた物質評価方法及び物質評価装置 (2020)
  • Inventor(s): 倉持昌弘、佐々木裕次、三尾和弘
  • Industrial Property Rights Holder: 倉持昌弘、佐々木裕次、三尾和弘
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2020