Development of photo labeling technology that enables analysis of intracellular protein-protein interaction

• Project Area: Chemical Approaches for Miscellaneous / Crowding Live Systems
• Project/Area Number: 20H04699
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Tokyo Institute of Technology
• Principal Investigator: 中村 浩之 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 教授 (30274434)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2022-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000); Fiscal Year 2021: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000); Fiscal Year 2020: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
• Keywords: ケミカルラベリング / タンパク質間相互作用 / 生細胞内 / 有機光触媒 / チロシン / ラベル化 / タンパク質 / 細胞内

Outline of Research at the Start

あらゆる生物学的経路にはタンパク質－タンパク質相互作用（PPI）が関わる。この様々な生物学的経路を解明するために、PPI を検出・同定する技術の開発が求められている。本研究では、細胞内在性の色素を励起しない波長領域で活性化可能な光触媒を開発し、従来法では検出が困難であったPPI の検出・同定法を確立する。

Outline of Annual Research Achievements

あらゆる生物学的経路にはタンパク質-タンパク質相互作用(PPI)が関わる。この様々な生物学的経路を解明するために、PPI を検出・同定する技術の開発が求められている。本研究では、生細胞内での細胞内光触媒近接場標識法（intracellular Photocatalytic-Proximity Labeling： iPPL法）の開発を目指し、従来法では検出が困難であったPPI の検出・同定法を確立することを目的として研究を遂行した。
本年度は、DNA翻訳や複製においてPPI パートナーが時空間的に変化するヒストンH2Bを対象タンパク質に選択した。令和2年度にで確立した手法により細胞内のH2BのN末に、HaloTagを強制発現させ、有機光触媒-HaloTag リガンド連結分子を作用させることで光触媒を細胞内へ導入した。その結果、遺伝的に発現したHaloTag-H2Bのほとんどがクロマチンに局在し、アクリフラビン結合HaloTagがこのH2Bに結合していることが示された。そこで、ラジカル標識剤にMAUra-DTBを用いて青色LEDで１分間照射を行い、iPPLにより標識されたタンパク質をウェスタンブロットにより明らかにした。特に分子量15 kDaにはヒストンタンパク質H2A, H2B, H3, H4が含まれていた。さらにMS/MS分析を行い、ヒストンH2B-インタラクトームを特定したところ、検出された87個のタンパク質のうち、33個がiPPLで有意に標識されたタンパク質であり、染色体タンパク質16個を含む30個の核タンパク質が同定され、iPPLが核内で進行していることが示された。遺伝子オントロジー解析によると、標識タンパク質にはリボ核タンパク質複合体、ヌクレオソーム、スプライソソーム複合体などが含まれている一方で、BioIDで標識されるDNA結合タンパク質は標識されなかった。以上、本研究ではタンパク質夾雑空間解析のためのiPPL法の開発に成功した。iPPLはBioIDやAPEX法よりも標識半径が小さいため、より焦点を絞ったPPIプロファイリングが可能と考えられる。

Research Progress Status

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Intracellular photocatalytic-proximity labeling for profiling protein?protein interactions in microenvironments (2022)
  • Author(s): Tsushima Michihiko、Sato Shinichi、Miura Kazuki、Niwa Tatsuya、Taguchi Hideki、Nakamura Hiroyuki
  • Journal Title: Chemical Communications Volume: 58 Issue: 12 Pages: 1926-1929
  • DOI: 10.1039/d1cc05764b
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] BODIPY Catalyzes Proximity‐Dependent Histidine Labelling (2022)
  • Author(s): Nakane Keita、Niwa Tatsuya、Tsushima Michihiko、Tomoshige Shusuke、Taguchi Hideki、Nakamura Hiroyuki、Ishikawa Minoru、Sato Shinichi
  • Journal Title: ChemCatChem Volume: - Issue: 9
  • DOI: 10.1002/cctc.202200077
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Proximity Histidine Labeling by Umpolung Strategy Using Singlet Oxygen (2021)
  • Author(s): Nakane Keita、Sato Shinichi、Niwa Tatsuya、Tsushima Michihiko、Tomoshige Shusuke、Taguchi Hideki、Ishikawa Minoru、Nakamura Hiroyuki
  • Journal Title: Journal of the American Chemical Society Volume: 143 Issue: 20 Pages: 7726-7731
  • DOI: 10.1021/jacs.1c01626
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Synthesis of Three‐Dimensional (Di)Azatricyclododecene Scaffold and Its Application to Peptidomimetics (2021)
  • Author(s): Umedera Kohei、Morita Taiki、Yoshimori Atsushi、Yamada Kentaro、Katoh Akira、Kouji Hiroyuki、Nakamura Hiroyuki
  • Journal Title: Chemistry ? A European Journal Volume: 27 Issue: 46 Pages: 11888-11894
  • DOI: 10.1002/chem.202101440
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Preparation of an antigen-responsive fluorogenic immunosensor by tyrosine chemical modification of the antibody complementarity determining region (2021)
  • Author(s): Sato Shinichi、Matsumura Masaki、Ueda Hiroshi、Nakamura Hiroyuki
  • Journal Title: Chemical Communications Volume: 57 Issue: 76 Pages: 9760-9763
  • DOI: 10.1039/d1cc03231c
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Development of curcumin-based amyloid β aggregation inhibitors for Alzheimer's disease using the SAR matrix approach (2021)
  • Author(s): Yudi Utomo Rohmad、Asawa Yasunobu、Okada Satoshi、Ban Hyun Seung、Yoshimori Atsushi、Bajorath J?rgen、Nakamura Hiroyuki
  • Journal Title: Bioorganic & Medicinal Chemistry Volume: 46 Pages: 116357-116357
  • DOI: 10.1016/j.bmc.2021.116357
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Carborane as an Alternative Efficient Hydrophobic Tag for Protein Degradation (2021)
  • Author(s): Asawa Yasunobu、Nishida Kei、Kawai Kazuki、Domae Kiyotaka、Ban Hyun Seung、Kitazaki Akihiro、Asami Hiroya、Kohno Jun-Ya、Okada Satoshi、Tokuma Hiraku、Sakano Daisuke、Kume Shoen、Tanaka Masaru、Nakamura Hiroyuki
  • Journal Title: Bioconjugate Chemistry Volume: 32 Issue: 11 Pages: 2377-2385
  • DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.1c00431
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Labeling of Peroxide-Induced Oxidative Stress Hotspots by Hemin-Catalyzed Tyrosine Click (2020)
  • Author(s): Sato Shinichi、Nakamura Hiroyuki
  • Journal Title: Chemical and Pharmaceutical Bulletin Volume: 68 Issue: 9 Pages: 885-890
  • DOI: 10.1248/cpb.c20-00434
  • NAID: 130007893822
  • ISSN: 0009-2363, 1347-5223
  • Year and Date: 2020-09-01
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Site-Selective Protein Chemical Modification of Exposed Tyrosine Residues Using Tyrosine Click Reaction (2020)
  • Author(s): Sato Shinichi、Matsumura Masaki、Kadonosono Tetsuya、Abe Satoshi、Ueno Takafumi、Ueda Hiroshi、Nakamura Hiroyuki
  • Journal Title: Bioconjugate Chemistry Volume: in press Issue: 5 Pages: 1417-1424
  • DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.0c00120
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A laccase-catalysed tyrosine click reaction (2020)
  • Author(s): Sato Shinichi、Nakane Keita、Nakamura Hiroyuki
  • Journal Title: Organic & Biomolecular Chemistry Volume: 18 Issue: 19 Pages: 3664-3668
  • DOI: 10.1039/d0ob00650e
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Target Protein Identification on Photocatalyst-Functionalized Magnetic Affinity Beads (2020)
  • Author(s): 對馬理彦、佐藤伸一、中根啓太、中村浩之
  • Journal Title: Current Protocols in Protein Science Volume: 101 Issue: 1 Pages: 1-25
  • DOI: 10.1002/cpps.108
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Development of Intracellular Photocatalytic Proximity Protein Labeling (iPPL) (2022)
  • Author(s): Hiroyuki Nakamura
  • Organizer: 9th International Conference on Chemical and Biological Sciences
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 細胞透過型有機光触媒による標的タンパク質選択的不活性化と抗腫瘍活性プローブへの応用 (2022)
  • Author(s): 三浦一輝、Wen Yijin、對馬 理彦、中村浩之
  • Organizer: 日本薬学会142春季年会
• [Presentation] 細胞内タンパク質間相互作用解析のための光触媒近接タンパク質標識法の開発 (2021)
  • Author(s): 對馬理彦、三浦一輝、佐藤伸一、丹羽達也、田口英樹、中村浩之
  • Organizer: 日本ケミカルバイオロジー学会第１５回年会
• [Presentation] 一重項酸素を活用したヒスチジン残基近接標識法の開発 (2021)
  • Author(s): 中根啓太、丹羽達也、對馬理彦、田口英樹, 友重秀介、中村浩之、石川稔、佐藤伸一
  • Organizer: 日本ケミカルバイオロジー学会第１５回年会
• [Presentation] チロシン残基特異的ラベル化技術の開発 (2021)
  • Author(s): 中村浩之
  • Organizer: 同仁化学研究所セミナー
  • Invited
• [Presentation] Development of photocatalytic-proximity protein labeling for profiling protein-protein interaction in intracellular microenvironments (2021)
  • Author(s): Hiroyuki Nakamura, Michihiko Tsushima, Shinichi Sato, Kazuki Miura
  • Organizer: Pacifichem
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Tyrosine Residue-Specific Chemical Modification and Its Application (2021)
  • Author(s): H. Nakamura, M. Tsushima, M. Matsumura, S. Sato
  • Organizer: XI International Conference on Chemistry Young Scientists (Mendeleev 2021)
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 細胞内微小空間で起こるタンパク質間相互作用の解析を可能にする光触媒近接タンパク質ラベル化法の開発 (2021)
  • Author(s): 對馬理彦、佐藤伸一、中村浩之
  • Organizer: 日本化学会第101春季年会
• [Presentation] ペルオキシダーゼ活性の変化と近接標識を利用したグアニン四重鎖結合タンパク質の選択的化学修飾 (2020)
  • Author(s): 佐藤伸一、増澤樹、大吉崇文、丹羽達也、田口英樹、中村浩之
  • Organizer: 第14回バイオ関連化学シンポジウム
• [Presentation] タンパク質-タンパク質相互作の解析を志向した細胞内触媒近接ラベル化の開発 (2020)
  • Author(s): 對島理彦、佐藤伸一、中村浩之
  • Organizer: 第64回日本薬学会関東支部大会
• [Presentation] Development of Protein Chemical Labeling: From Target Identification to Cancer Therapy (2020)
  • Author(s): Hiroyuki Nakamura
  • Organizer: The 21st RIES-Hokudai International Symposium
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Book] カレントレビュー 43「有機光反応の化学」 (2022)
  • Author(s): 中村浩之、盛田大輝
  • Total Pages: 210
  • Publisher: 化学同人
  • ISBN: 9784759814033
• [Patent(Industrial Property Rights)] 高反応性試薬によるチロシン残基修飾 (2020)
  • Inventor(s): 佐藤伸一、中村浩之
  • Industrial Property Rights Holder: 東京工業大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2020