Binding mode analysis of target molecules on the cellular crowding systems using bioactive fluorescent probes

• Project Area: Chemical Approaches for Miscellaneous / Crowding Live Systems
• Project/Area Number: 20H04703
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 北 将樹 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (30335012)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2022-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000); Fiscal Year 2021: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000); Fiscal Year 2020: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
• Keywords: 細胞夾雑系 / N,N-ジメチルアミノピレン / ラベル支援レーザー脱離イオン化質量分析法 / 標的分子の同定 / 局在解析

Outline of Research at the Start

N,N-ジメチルアミノピレン(dmpy)基は，ラベル支援レーザー脱離イオン化質量分析法（LA-LDI MS）のために開発した蛍光タグであり、標的タンパク質の同定やリガンドの結合位置解析に有用である．本研究では，リガンド解離型および光親和性dmpyプローブを合成し，細胞夾雑系における標的分子の効率的なラベル化と細胞内局在解析を目指す．また新規なLA-LDI MSタグの開発や，様々な生体分子の効率的なラベル化法も検討する．

Outline of Annual Research Achievements

蛍光基ピレンを持つ化合物は、マトリックスを使用しないラベル支援レーザー脱離イオン化質量分析法(LA-LDI MS)で選択的に励起・検出される。これまでに、従来よりも約10万倍高感度でLA-LDI MS検出できるN,N-ジメチルアミノピレン(dmpy)基を開発した。また、ゲルろ過樹脂を用いてdmpyラベル化タンパク質およびペプチドを簡便に脱塩・精製して選択的にMSで検出できる。本研究では、リガンド解離型および光親和性dmpyプローブを合成し、細胞夾雑系における標的分子の効率的なラベル化と細胞内局在解析を行うことを目指した。
リガンド解離型dmpyプローブの設計と合成では、リガンドにベンゼンスルホン酸やビオチン、検出基にdmpy基を持つリガンド解離型プローブを合成した。反応性官能基にNASAを用いることで、標的タンパク質である炭酸脱水素酵素やアビジンの位置選択的なラベル化に成功した。さらに細胞内夾雑系のモデル反応として、培養細胞の抽出タンパク質を含む系で上記のプローブとの反応を検討し、アビジンの選択的なラベル化に成功した。
さらに、リガンド、反応性官能基(ジアジリン)、検出基(dmpyや(歪み)アルキン)を持つ光親和性プローブを合成し、精製タンパク質や細胞抽出液と混合してUV365の照射により共有結合を形成させる条件を検討した。365 nm 単波長レーザーを用いた紫外線装置により、10秒以下という短時間で水溶液やメタノール溶液中にてジアジリン基が効率的に反応し、溶媒との共有結合が反応することを見出した。今後は培養細胞におけるラベル化を検討し、dmpyラベル化産物の簡便な精製法を確立する。また分子モデリング計算(MOE)による結合様式の解析や、生細胞蛍光イメージングによるdmpy基の局在解析を行う予定である。

Research Progress Status

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Flavokawains, Plant-derived Chalcones, Inhibit Differentiation of Murine Pre-adipocytes (2022)
  • Author(s): Hanif Novriyandi、Iswantini Dyah、Hioki Yusuke、Murni Anggia、Kita Masaki、Tanaka Junichi
  • Journal Title: Chemistry Letters Volume: 51 Issue: 1 Pages: 54-57
  • DOI: 10.1246/cl.210615
  • NAID: 130008137579
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Eumitrins F-H: three new xanthone dimers from the lichen <i>Usnea baileyi</i> and their biological activities (2022)
  • Author(s): Nguyen Van-Kieu、Nguyen-Si Hoai-Vu、Devi Asshaima Paramita、Poonsukkho Pakarapon、Sangvichien Ek、Tran Thanh-Nha、Yusuke Hioki、Mitsunaga Tohru、Chavasiri Warinthorn
  • Journal Title: Natural Product Research Volume: 無し Issue: 9 Pages: 1-11
  • DOI: 10.1080/14786419.2021.2023143
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 6‐Paradol Acts as a Potential Anti‐obesity Vanilloid from Grains of Paradise (2021)
  • Author(s): Hattori Hiroyuki、Mori Takashi、Shibata Takahiro、Kita Masaki、Mitsunaga Tohru
  • Journal Title: Molecular Nutrition &amp; Food Research Volume: 65 Issue: 16 Pages: 2100185-2100185
  • DOI: 10.1002/mnfr.202100185
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The C29-C34 parts of antitumor macrolide aplyronine A serve as versatile actin-affinity tags (2021)
  • Author(s): Utomo Didik Huswo、Fujieda Akari、Tanaka Kentaro、Takahashi Momoko、Futaki Kentaro、Tanabe Kenta、Kigoshi Hideo、Kita Masaki
  • Journal Title: Chemical Communications Volume: 57 Issue: 81 Pages: 10540-10543
  • DOI: 10.1039/d1cc04259a
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] N,N-Dimethylaminopyrene as a fluorescent affinity mass tag for ligand-binding mode analysis (2020)
  • Author(s): Arai Atsushi、Watanabe Rei、Hattori Atsunori、Iio Keita、Hu Yaping、Yoneda Kozo、Kigoshi Hideo、Kita Masaki
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 10 Issue: 1 Pages: 7311-7311
  • DOI: 10.1038/s41598-020-64321-9
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Isolation and structure?activity relationship studies of jacaranones: Anti-inflammatory quinoids from the Cuban endemic plant Jacaranda arborea (Bignoniaceae) (2020)
  • Author(s): Hirukawa Minako、Zhang Menghua、Echenique?Diaz Lazaro M.、Mizota Koji、Ohdachi Satoshi D.、Begu??Quiala Gerardo、Delgado?Laba?ino Jorge L.、G?mez?D?ez Jorgelino、Alvarez?Lemus Jos?、Machado Leandro Galano、N??ez Miguel Su?rez、Shibata Takahiro、Kigoshi Hideo、Kita Masaki
  • Journal Title: Tetrahedron Letters Volume: 61 Issue: 26 Pages: 152005-152005
  • DOI: 10.1016/j.tetlet.2020.152005
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Acyl-CoA dehydrogenase long chain (ACADL) is a target protein of stylissatin A, an anti-inflammatory cyclic heptapeptide (2020)
  • Author(s): Zhang Menghua、Sunaba Taiki、Sun Yiting、Shibata Takahiro、Sasaki Kazunori、Isoda Hiroko、Kigoshi Hideo、Kita Masaki
  • Journal Title: The Journal of Antibiotics Volume: 73 Issue: 8 Pages: 589-592
  • DOI: 10.1038/s41429-020-0322-5
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] Binding mode analysis of target molecules on the cellular crowding systems using bioactive fluorescent probes. (2022)
  • Author(s): M. Kita
  • Organizer: 第二回分子夾雑化学国際会議 (CMCB2022) 東京（オンライン）
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] キューバ産植物由来抗炎症物質jacaranoneの作用メカニズム解析 (2022)
  • Author(s): 蛭川美奈子、北将樹、柴田貴広
  • Organizer: 日本農芸化学会2022年度大会, 京都（オンライン）
• [Presentation] Target identification and binding mode analysis of bioactive natural products. (2021)
  • Author(s): M. Kita
  • Organizer: A3フォーサイト事業取りまとめシンポジウム, TKPガーデンシティ仙台
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] M. Kita, D. H. Utomo, M. Morita, and H. Kigoshi (2021)
  • Author(s): Chemical Biology and Ecology Studies on Aplyronine A, A PPI-inducing Antitumor Macrolide from Sea Hare.
  • Organizer: The 2021 International Chemical Congress of Pacific Basin Societies (PACIFICHEM2021), Hawaii, USA (on-line)
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Anti-inflammation and adipogenesis inhibition functions of stylissatin A: Structure-activity relationship, target identification, and mode of action studies. (2021)
  • Author(s): Masaki Kita, Menghua Zhang, Taiki Sunaba, Yiting Sun, Takahiro Shibata, Kazunori Sasaki, Hiroko Isoda, and Hideo Kigoshii
  • Organizer: The 2021 International Chemical Congress of Pacific Basin Societies (PACIFICHEM2021) Hawaii, USA (on-line)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Revealing Binding Position of Aplyronine A as A Protein-Protein Interaction Inducer. (2021)
  • Author(s): Didik H. Utomo, Maho Morita, Hideo Kigoshi, and Masaki Kita
  • Organizer: The 2021 International Chemical Congress of Pacific Basin Societies (PACIFICHEM2021) Hawaii, USA（オンライン）
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Jacaranone, an anti-inflammatory quinoid from the Cuban endemic plant Jacaranda sp. (2021)
  • Author(s): Minako Hirukawa, Lazaro M. Echenique-Diaz, Koji Mizota, Satoshi D. Ohdachi, Gerardo Begue; Quiala, Jorge L. Delgado; Labanino, Jorgelino Gamez Diez, Takahiro Shibata, Maho Morita, Masaki Kita
  • Organizer: The 2021 International Chemical Congress of Pacific Basin Societies (PACIFICHEM2021) Hawaii, USA (on-line)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 細胞夾雑系における生理活性蛍光リガンドを用いた標的分子の結合様式解析. (2021)
  • Author(s): 北将樹
  • Organizer: 分子夾雑の生命化学 第６回領域会議、東京（オンライン）
• [Presentation] Target identification and binding mode analysis of bioactive marine natural products. (2021)
  • Author(s): M. Kita
  • Organizer: 理研CSRSランチョンセミナー, 理研環境資源科学研究センター（オンライン）
  • Invited
• [Presentation] リガンド解離型ピレンプローブを用いたプロテアーゼのラベル化 (2021)
  • Author(s): 津田智仁、荒井厚志、北将樹
  • Organizer: 日本化学会第101春季年会（口頭発表）
• [Presentation] 細胞夾雑系における生理活性蛍光リガンドを用いた標的分子の結合様式解析 (2020)
  • Author(s): 北将樹
  • Organizer: 新学術領域研究（分子夾雑化学）オンラインセミナー
• [Presentation] リガンド解離型ピレンプローブを用いた標的分子の結合様式解析 (2020)
  • Author(s): 北将樹
  • Organizer: 新学術領域研究（分子夾雑化学）第１回東海地区シンポジウム
• [Book] Discovery and use of natural products and derivatives as chemical probes. in The Discovery and Utility of Chemical Probes in Target Discovery, Eds. P. Brennan & S. V. Rodriguez (2020)
  • Author(s): Masaki Kita and Hideo Kigoshi
  • Total Pages: 26
  • Publisher: The Royal Society of Chemistry
  • ISBN: 9781788015899
• [Remarks] 名古屋大学 生命農学研究科 天然物ケミカルバイオロジー研究室
  • URL: https://mkita64.wixsite.com/mysite
• [Remarks] 名古屋大学 大学院生命農学研究科 天然物ケミカルバイオロジー研究室
  • URL: https://mkita64.wixsite.com/mysite