Mirror-image Artificial Antibody Working in Multimolecular Crowding Biosystems

• Project Area: Chemical Approaches for Miscellaneous / Crowding Live Systems
• Project/Area Number: 20H04704
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 林 剛介 名古屋大学, 工学研究科, 准教授 (40648268)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2022-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000); Fiscal Year 2021: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000); Fiscal Year 2020: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
• Keywords: タンパク質化学合成 / in vitroセレクション / 人工抗体 / 進化分子工学 / 分子進化工学

Outline of Research at the Start

本研究では、タンパク質化学合成法と進化分子工学を用いた人工抗体取得技術を組み合わせることで、生体内や細胞内などの分子夾雑系において機能する鏡像異性体（D体）人工抗体を開発する。具体的には、標的とするタンパク質の鏡像異性体をタンパク質化学合成法によって作製し、得られたD体タンパク質を基質としてTRAP提示法（mRNA提示法の改良法）による人工抗体の選択を行う。得られた人工抗体配列をD体アミノ酸を用いて化学合成することで、目的のD体人工抗体を得る。その後、合成したD体人工抗体の結合性や免疫原性などの特性をL体人工抗体と比較することで評価する。

Outline of Annual Research Achievements

2021年度は、（１）化学合成人工抗体モノボディの機能評価、（２）D体MCP-1結合モノボディのin vitroセレクションと最適化、（３）L体MCP-1結合D体モノボディの化学合成と評価、を行った。
本研究の最終目的は、D体アミノ酸から構成される人工抗体をミラーイメージin vitroセレクション法によって創製することにあるが、まずは化学合成で合成した人工抗体（本研究ではモノボディを使用）が正しくフォールディングし、標的蛋白質に結合することを確認する必要がある。そこで（１）では、2020年度に合成を完了した新型コロナウイルスSタンパク質結合モノボディの機能評価を行った。バイオレイヤー干渉法を用いて化学合成モノボディとSタンパク質の結合を調べたところ、数nM程度のKdで化学合成モノボディが結合することが明らかとなった。また化学合成モノボディは大腸菌発現モノボディ同様に、オリゴマー状態（10-12量体）で存在することがサイズ排除クロマトグラフィー分析から明らかとなった。
次に、2020年度に取得したD体MCP-1結合モノボディの結合定数が数100nMとあまり良いクローンが得られなかったため、（２）では、親和性成熟あるいは新規ライブラリによる結合能が上昇したクローンの取得を試みた。その結果、数nM程度とD体MCP-1に対して十分な結合能を持つクローンの取得に成功した。そこで（３）では、（２）で得られたクローン配列をD体アミノ酸を用いて化学合成を行った。具体的には、4つのペプチド断片からPd錯体を用いたワンポットペプチド連結法を用いて合成を完了した。得られたD体モノボディがL体MCP-1に結合することが明らかとなった。

Research Progress Status

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Monobodies with potent neutralizing activity against SARS-CoV-2 Delta and other variants of concern (2022)
  • Author(s): Kondo Taishi、Matsuoka Kazuhiro、Umemoto Shun、Fujino Tomoshige、Hayashi Gosuke、Iwatani Yasumasa、Murakami Hiroshi
  • Journal Title: Life Science Alliance Volume: 5 Issue: 6 Pages: e202101322-e202101322
  • DOI: 10.26508/lsa.202101322
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Base-Resolution Analysis of 5-Hydroxymethylcytidine by Selective Oxidation and Reverse Transcription Arrest (2021)
  • Author(s): Koyama, K.; Hayashi, G.; Ueda, H.; Ota, S.; Nagae, G.; Aburatani, H.; Okamoto, A.
  • Journal Title: Org. Biomol. Chem. Volume: 19 Issue: 29 Pages: 6478-6486
  • DOI: 10.1039/d1ob00995h
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Construction of a Highly Diverse mRNA Library for in vitro Selection of Monobodies (2021)
  • Author(s): Kondo Taishi、Eguchi Minori、Tsuzuki Nariaki、Murata Naoya、Fujino Tomoshige、Hayashi Gosuke、Murakami Hiroshi
  • Journal Title: BIO-PROTOCOL Volume: 11 Issue: 16
  • DOI: 10.21769/bioprotoc.4125
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Silyl-Protected Propargyl Glycine for Multiple Labeling of Peptides by Chemoselective Silyl-Deprotection (2021)
  • Author(s): Kamo, N.; Hayashi, G.; Okamoto, A.
  • Journal Title: Tetrahedron Lett. Volume: 73 Pages: 153093-153093
  • DOI: 10.1016/j.tetlet.2021.153093
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Organoruthenium-Catalyzed Chemical Protein Synthesis to Elucidate the Functions of Epigenetic Modifications on Heterochromatin Factors (2021)
  • Author(s): Kamo, N.; Kujirai, T.; Kurumizaka, H.; Murakami, H.; Hayashi, G.; Okamoto, A.
  • Journal Title: Chem. Sci. Volume: 12 Issue: 16 Pages: 5926-5937
  • DOI: 10.1039/d1sc00731a
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] cDNA TRAP display for rapid and stable in vitro selection of antibody-like proteins (2021)
  • Author(s): Kondo Taishi、Eguchi Minori、Kito Seita、Fujino Tomoshige、Hayashi Gosuke、Murakami Hiroshi
  • Journal Title: Chemical Communications Volume: 57 Issue: 19 Pages: 2416-2419
  • DOI: 10.1039/d0cc07541h
  • NAID: 120007169556
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Acetylation-modulated communication between the H3 N-terminal tail domain and the intrinsically disordered H1 C-terminal domain (2020)
  • Author(s): Hao, F; Murphy, K. J.; Kujirai, T.; Kamo, N.; Kato, J.; Koyama, M.; Okamato, A.; Hayashi, G.; Kurumizaka, H.; Hayes, J. J.
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. Volume: 48 Issue: 20 Pages: 11510-11520
  • DOI: 10.1093/nar/gkaa949
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] L-DNA-tagged fluorescence in situ hybridization for highly sensitive imaging of RNAs in single cells (2020)
  • Author(s): Ogata, M.; Hayashi, G.; Ichiu, A.; Okamoto, A.
  • Journal Title: Org. Biomol. Chem. Volume: 18 Issue: 40 Pages: 8084-8088
  • DOI: 10.1039/d0ob01635g
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Antibody-like proteins that capture and neutralize SARS-CoV-2 (2020)
  • Author(s): Kondo T.、Iwatani Y.、Matsuoka K.、Fujino T.、Umemoto S.、Yokomaku Y.、Ishizaki K.、Kito S.、Sezaki T.、Hayashi G.、Murakami H.
  • Journal Title: Science Advances Volume: 6 Issue: 42 Pages: 3916-3916
  • DOI: 10.1126/sciadv.abd3916
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Fmoc-Compatible and C-terminal-Sequence-Independent Peptide Alkyl Thioester Formation Using Cysteinylprolyl Imide (2020)
  • Author(s): Nakatsu, K.; Yanase, M.; Hayashi, G.; Okamoto, A.
  • Journal Title: Org. Lett. Volume: 22 Issue: 12 Pages: 4670-4674
  • DOI: 10.1021/acs.orglett.0c01450
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Toolbox for chemically synthesized histone proteins (2020)
  • Author(s): Nakatsu, K.; Hayashi, G.; Okamoto, A.
  • Journal Title: Curr. Opin. Chem. Biol. Volume: 58 Pages: 10-19
  • DOI: 10.1016/j.cbpa.2020.04.016
  • Peer Reviewed
• [Presentation] タンパク質化学合成 -低分子抗体の高機能化を目指して- (2022)
  • Author(s): 林 剛介
  • Organizer: 日本薬学会第142年会
  • Invited
• [Presentation] Fluorophore-labeled Synthetic Histone Proteins for Investigation of Nucleosome Dynamics (2021)
  • Author(s): Gosuke Hayashi
  • Organizer: PACIFICHEM2021
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] New Peptide Ligation Techniques for Enhanced Chemical Protein Synthesis (2021)
  • Author(s): Gosuke Hayashi
  • Organizer: PACIFICHEM2021
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Advanced Chemical Synthesis of Modified Histone Proteins for Epigenetic Research (2021)
  • Author(s): Gosuke Hayashi
  • Organizer: PACIFICHEM2021
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 有機化学と進化分子工学を活用したユビキチンケモテクノロジー (2021)
  • Author(s): 林 剛介
  • Organizer: 第44回日本分子生物学会年会
  • Invited
• [Presentation] タンパク質に代表されるポリアミド型定序配列分子の化学合成 (2021)
  • Author(s): 林 剛介
  • Organizer: 第25回VBLシンポジウム
  • Invited
• [Presentation] もう今はタンパク質もつくれます (2021)
  • Author(s): 林 剛介
  • Organizer: 第11回CSJ化学フェスタ2021
  • Invited
• [Presentation] タンパク質を全合成するための最先端分子技術 (2021)
  • Author(s): 林 剛介
  • Organizer: 令和3年度 有機合成化学協会東海支部 若手研究者のためのセミナー
  • Invited
• [Presentation] 修飾ヒストンの効率的化学合成法とヒストン動態解析 (2021)
  • Author(s): 林剛介
  • Organizer: 第14回日本エピジェネティクス研究会年会
• [Presentation] タンパク質化学合成技術を駆使した修飾タンパク質の創製と生化学研究への展開 (2020)
  • Author(s): 林剛介
  • Organizer: 第93回日本生化学会大会
  • Invited
• [Book] 最先端ナノライフシステム研究「進化分子工学を用いた人工抗体創製とその応用」 (2022)
  • Author(s): 近藤太志; 梅本駿; 藤野公茂; 林剛介; 村上裕
  • Total Pages: 6
  • Publisher: 名古屋大学
• [Book] 創薬研究者がこれだけは知っておきたい最新のウイルス学「新型コロナウイルスに対する迅速な人工抗体創製」 (2021)
  • Author(s): 近藤太志; 梅本駿; 藤野公茂; 林剛介; 村上裕
  • Total Pages: 10
  • Publisher: 株式会社NTS
• [Patent(Industrial Property Rights)] 62.フィブロネクチンIII型ドメイン骨格を含むポリペプチド (2020)
  • Inventor(s): 村上裕、都築成晃、近藤大志、林剛介、藤野公茂
  • Industrial Property Rights Holder: 村上裕、都築成晃、近藤大志、林剛介、藤野公茂
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2020
• [Patent(Industrial Property Rights)] 63.SARS-CoV-2のSタンパク質に結合する人工抗体 (2020)
  • Inventor(s): 村上裕、近藤大志、藤野公茂、林剛介、梅本駿
  • Industrial Property Rights Holder: 村上裕、近藤大志、藤野公茂、林剛介、梅本駿
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2020
  • Overseas