分子夾雑環境におけるプロテオフォーム動態のトップダウンプロテオミクス解析

• Project Area: Chemical Approaches for Miscellaneous / Crowding Live Systems
• Project/Area Number: 20H04713
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Ehime University
• Principal Investigator: 武森 信暁 愛媛大学, 学術支援センター, 講師 (40533047)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2022-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000); Fiscal Year 2021: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000); Fiscal Year 2020: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
• Keywords: プロテオフォーム / 質量分析 / トップダウンプロテオミクス / プロテオスタシス / ターゲットプロテオミクス

Outline of Research at the Start

本研究では、生体内タンパク質の各種バリアント（プロテオフォーム）の包括的解析を可能にする次世代プロテオーム解析技術「トップダウンプロテオミクス」を駆使して、分子夾雑環境にあるプロテオフォームの恒常性を理解するための革新的計測手法を開発する。本研究により、動物個体のプロテオフォーム動態を解析するための計測基盤が構築される。培養細胞レベルではなく、組織レベルにおいて加齢や疾患に伴う詳細なプロテオスタシスの変化を捉えることが可能となるため、プロテオスタシス研究のブレークスルーとなることが期待できる。

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではプロテオフォームを高感度に解析するための新しい質量分析技術を開発し、生体内の分子夾雑環境におけるプロテオフォーム動態を理解するための計測基盤を構築することを目的とする。今年度は研究代表がこれまでに確立したSDS-PAGEベースのプロテオーム分画法であるPEPPI-MSを活用して、トップダウン質量分析による高深度プロテオフォーム解析システムの開発をおこなった。PEPPI分画にはタンパク質のイオン化を強く抑制する夾雑成分（アクリルアミドフィラメント、SDS、泳動バッファー等）が大量に含まれており、現状では有機溶媒を用いた沈殿処理によりタンパク質を精製してから解析を行っている。有機溶媒による精製は、SDSやCBBの効果的かつ低コストな除去を可能にするが、低分子量タンパク質の損失や、沈殿タンパク質の再溶解が困難となることが問題である。そこで本研究では有機溶媒沈殿に代わる精製法として、アニオン交換固相抽出スピンカラムを用いたインタクトタンパク質精製法を新たに開発した。開発手法ではサンプルを陰イオン交換SPEカラムに一旦捕獲し、CBBやSDSなどの質量分析を妨げる夾雑物を除去することが可能であり、トップダウン質量分析のための迅速なサンプル精製が可能であった。精製サンプルの評価は、クリスティアン・アルブレヒト大学キールのAndreas Tholey教授のグループとの共同研究により高性能オービトラップ型質量分析装置を用いて実施した。その結果、新規精製法の導入により検出可能なプロテオフォーム数が約２倍向上することが明らかとなった。

Research Progress Status

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Kiel University (CAU)(ドイツ)
• [Int'l Joint Research] UCLA/国立高磁場研究所(米国)
• [Int'l Joint Research] リバプール大学(英国)
• [Journal Article] Bottom-up/cross-linking mass spectrometry <i>via</i> simplified sample processing on anion-exchange solid-phase extraction spin column (2022)
  • Author(s): Takemori Ayako、Kawashima Yusuke、Takemori Nobuaki
  • Journal Title: Chemical Communications Volume: 58 Issue: 6 Pages: 775-778
  • DOI: 10.1039/d1cc05529a
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた高分解能プロテオーム分画法の開発とトップダウンプロテオミクスへの応用 (2022)
  • Author(s): 武森 信暁
  • Journal Title: 電気泳動 Volume: 66
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A novel proteomics strategy based on dissolvable polyacrylamide gel electrophoresis (2021)
  • Author(s): 武森 信曉
  • Journal Title: Electrophoresis Letters Volume: 65 Issue: 2 Pages: 63-68
  • DOI: 10.2198/electroph.65.63
  • NAID: 130008072902
  • ISSN: 2189-2628, 2189-2636
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] PEPPI-MS: Polyacrylamide-Gel-Based Prefractionation for Analysis of Intact Proteoforms and Protein Complexes by Mass Spectrometry (2020)
  • Author(s): Takemori Ayako、Butcher David S.、Harman Victoria M.、Brownridge Philip、Shima Keisuke、Higo Daisuke、Ishizaki Jun、Hasegawa Hitoshi、Suzuki Junpei、Yamashita Masakatsu、Loo Joseph A.、Loo Rachel R. Ogorzalek、Beynon Robert J.、Anderson Lissa C.、Takemori Nobuaki
  • Journal Title: Journal of Proteome Research Volume: 19 Issue: 9 Pages: 3779-3791
  • DOI: 10.1021/acs.jproteome.0c00303
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] BAC-DROP: Rapid Digestion of Proteome Fractionated via Dissolvable Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Its Application to Bottom-Up Proteomics Workflow (2020)
  • Author(s): Takemori Ayako、Ishizaki Jun、Nakashima Kenji、Shibata Takeshi、Kato Hidemasa、Kodera Yoshio、Suzuki Tetsuro、Hasegawa Hitoshi、Takemori Nobuaki
  • Journal Title: Journal of Proteome Research Volume: 20 Issue: 3 Pages: 1535-1543
  • DOI: 10.1021/acs.jproteome.0c00749
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Mass spectrometry-based proteomics approach to reveal the structure and dynamics of cellular proteoforms (2022)
  • Author(s): Nobuaki Takemori
  • Organizer: 第二回分子夾雑化学国際会議（CMCB2022）
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] PEPPI-MS: トップダウンプロテオミクスのためのサンプル前分画ワークフロー (2021)
  • Author(s): 武森信曉
  • Organizer: 第72回日本電気泳動学会総会（オンライン）
  • Invited
• [Presentation] Gel-Based Proteomicsの新戦略 －トップダウン質量分析とSDS-PAGEの融合－ (2021)
  • Author(s): 武森信曉
  • Organizer: 第18回北里疾患プロテオーム研究会
  • Invited
• [Presentation] Gel-Based Top-Down Proteomics: プロテオミクス研究領域におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動の新規活用法 (2020)
  • Author(s): 武森信曉
  • Organizer: 第71回日本電気泳動学会総会
  • Invited