Development of inhibiotrs for reactive sulfur species-producing enzymes by utilizing fluorescent probes and their biological analysis

• Project Area: Frontier research of chemical communications
• Project/Area Number: 20H04767
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Keio University (2021); The University of Tokyo (2020)
• Principal Investigator: 花岡 健二郎 慶應義塾大学, 薬学部(芝共立), 教授 (70451854)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2022-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000); Fiscal Year 2021: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000); Fiscal Year 2020: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
• Keywords: 薬学 / 分析科学 / 生体分子 / 分子認識 / 有機化学

Outline of Research at the Start

本研究において、依然として生物学研究において十分に実用な阻害剤が開発されていないCSE(cystathionine γ-lyase)及びCBS(cystathionine β-synthase)の選択的な阻害剤の開発を、独自に開発してきた活性イオウ分子を検出する蛍光プローブを用いて行う。さらに、開発した阻害剤を培養細胞へと応用することで、生細胞におけるこれら酵素の活性イオウ分子(H2Sを含む)の産生に関わる役割を明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題では、近年注目されている活性硫黄分子種の産生酵素として報告されているCSE(cystathionine γ-lyase)及びCBS(cystathionine β-synthase)の選択的阻害剤を独自に開発した蛍光プローブを用いて探索することを目指す。それによって、CSE及びCBSのH2Sを含む活性硫黄分子種の産生に関わる生細胞内での役割の解明に貢献していく。これまでに、同一領域の前回の公募研究にて、独自の蛍光プローブを用いた阻害剤のハイスループットスクリーニングによって、新たなCSE阻害剤を見出すことに成功している。さらに、見出したCSE阻害剤のin vitroでの阻害活性や阻害メカニズムをX線結晶解析やMD計算を用いることで明らかにしている。さらに令和2年度は、開発したCSE選択的阻害剤の特性を更に精査すると共に、培養細胞(HEK283T細胞)へと応用し、開発した阻害剤が細胞膜透過性を持ち、生細胞においても細胞内のCSEの酵素活性を阻害することが可能であることを明らかにした。
令和3年においては、新たにCBSの選択的な阻害剤のハイスループットスクリーニングを行うために、CBS蛋白質の大腸菌による大量発現を行うと共に、CBSの酵素基質であるシステイン及びホモシステインが高濃度に存在する場合においても低いバックグランド蛍光を示す、新たな阻害剤スクリーニング用の蛍光プローブの開発を行った。さらにそれを用いて阻害剤のハイスループットスクリーニングを行い、CBSに高い選択性を示す新たな阻害剤の開発に成功した。今後、本阻害剤の誘導体化によるCBS阻害活性の向上や生細胞でのCBS阻害剤の阻害活性の評価などを行っていく予定である。

Research Progress Status

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Massachusetts General Hospital/Indiana University School of Medicine(米国)
• [Int'l Joint Research] Massachusetts General Hospital(米国)
• [Int'l Joint Research] The German Cancer Research Center(ドイツ)
• [Journal Article] Establishment of live-cell-based coupled assay system for identification of compounds to modulate metabolic activities of cells (2021)
  • Author(s): Yanagi Kouichi、Komatsu Toru、Ogihara Shusuke、Okabe Takayoshi、Kojima Hirotatsu、Nagano Tetsuo、Ueno Tasuku、Hanaoka Kenjiro、Urano Yasuteru
  • Journal Title: Cell Reports Volume: 36 Issue: 1 Pages: 109311-109311
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2021.109311
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Sulfide catabolism ameliorates hypoxic brain injury. (2021)
  • Author(s): Marutani E, Morita M, Hirai S, Kai S, Grange RMH, Miyazaki Y, Nagashima F, Traeger L, Magliocca A, Ida T, Matsunaga T, Batten A, Li R, Tanaka T, Ikeda T, Nakagawa A, Atochin DN, Ihara H, Olenchock BA, Shen X, Nishida M, Hanaoka K, Kevil CG, Xian M, Bloch DB, Akaike T, Hindle AG, Motohashi H, Ichinose F, et al.
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 12 Issue: 1 Pages: 3108-3108
  • DOI: 10.1038/s41467-021-23363-x
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Matrix metalloprotease-14 is a target enzyme for detecting peritoneal metastasis in gastric cancer (2021)
  • Author(s): Soichiro Ogawa, Hidemasa Kubo, Yasutoshi Murayama, Takeshi Kubota, Masayuki Yubakami, Tatsuya Matsumoto, Takuma Ohashi, Kazuma Okamoto, Yugo Kuriki, Kenjiro Hanaoka, Yasuteru Urano, Eigo Otsuji
  • Journal Title: Photodiagnosis Photodyn. Ther. Volume: 35 Pages: 102420-102420
  • DOI: 10.1016/j.pdpdt.2021.102420
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Design, synthesis and evaluation of enzyme-responsive fluorogenic probes based on pyridine-flanked diketopyrrolopyrrole dyes (2021)
  • Author(s): Jenni Sebastien、Ponsot Flavien、Baroux Pierre、Collard Lucile、Ikeno Takayuki、Hanaoka Kenjiro、Quesneau Valentin、Renault K?vin、Romieu Anthony
  • Journal Title: Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy Volume: 248 Pages: 119179-119179
  • DOI: 10.1016/j.saa.2020.119179
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Recent advances in detection, isolation, and imaging techniques for sulfane sulfur-containing biomolecules (2021)
  • Author(s): Honami Echizen, Eita Sasaki, Kenjiro Hanaoka
  • Journal Title: Biomolecules Volume: 11 Issue: 11 Pages: 1553-1553
  • DOI: 10.3390/biom11111553
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Recent advances in probe design to detect reactive sulfur species and in the chemical reactions employed for fluorescence switching (2021)
  • Author(s): Echizen Honami、Hanaoka Kenjiro
  • Journal Title: Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition Volume: 68 Issue: 1 Pages: 9-17
  • DOI: 10.3164/jcbn.20-18
  • NAID: 130007965276
  • ISSN: 0912-0009, 1880-5086
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 超硫黄分子を検出するための蛍光プローブ開発 (2021)
  • Author(s): 佐々木栄太, 花岡健二郎
  • Journal Title: 生化学 Volume: 93 Pages: 604-612
• [Journal Article] Development of a small-molecule-based activatable photoacoustic probe (2021)
  • Author(s): Ikeno Takayuki, Hanaoka Kenjiro, Urano Yasuteru
  • Journal Title: Methods in Enzymology Volume: 657 Pages: 1-19
  • DOI: 10.1016/bs.mie.2021.06.041
  • ISBN: 9780323855303
• [Journal Article] A cytosolically localized far-red to near-infrared rhodamine-based fluorescent probe for calcium ions (2020)
  • Author(s): Numasawa Koji、Hanaoka Kenjiro、Ikeno Takayuki、Echizen Honami、Ishikawa Tomoe、Morimoto Masakazu、Komatsu Toru、Ueno Tasuku、Ikegaya Yuji、Nagano Tetsuo、Urano Yasuteru
  • Journal Title: The Analyst Volume: 145 Issue: 23 Pages: 7736-7740
  • DOI: 10.1039/d0an01739f
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 新規蛍光団の創製を基盤とした 蛍光プローブの開発 (2021)
  • Author(s): 花岡 健二郎
  • Organizer: 第42回 光化学若手の会
  • Invited
• [Presentation] 活性硫黄分子種を検出する蛍光プローブの開発とその応用 (2021)
  • Author(s): 花岡 健二郎
  • Organizer: 生理研研究会2021 生命を支える硫黄生物学の最前線
• [Presentation] 蛍光プローブを活用した活性イオウ分子産生酵素の阻害剤の探索/創製と機能解析 (2021)
  • Author(s): 花岡 健二郎
  • Organizer: 新学術領域研究「化学コミュニケーションのフロンティア」合同会議
• [Presentation] Development of a series of pH ratiometric fluorescence probes and their application to endosomal pH measurements (2021)
  • Author(s): Kenjiro Hanaoka
  • Organizer: PACIFICHEM2021
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Development of a pH ratiometric fluorescence probe for in vivo imaging and its biological applications (2021)
  • Author(s): Kenjiro Hanaoka
  • Organizer: PACIFICHEM2021
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Development of a fluorescence probe for H2S and its application to inhibitor screening for H2S/sulfane sulfur-producing enzymes (2021)
  • Author(s): Kenjiro Hanaoka
  • Organizer: PACIFICHEM2021
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 疾患組織を特異的に可視化する蛍光プローブの開発 (2021)
  • Author(s): 花岡 健二郎
  • Organizer: 自治医科大学 病理学セミナー
  • Invited
• [Presentation] 活性硫黄種を検出する蛍光プローブの開発と産生酵素の阻害剤スクリーニングへの応用 (2020)
  • Author(s): 花岡 健二郎
  • Organizer: フォーラム2020：衛生薬学・環境トキシコロジー
  • Invited
• [Presentation] 活性硫黄分子の産生酵素に対する選択的阻害剤の開発 (2020)
  • Author(s): 花岡 健二郎
  • Organizer: 第93回日本生化学会大会
  • Invited
• [Book] ファルマシア 「最前線」 (2021)
  • Author(s): 花岡 健二郎
  • Total Pages: 5
  • Publisher: 公益社団法人日本薬学会
• [Remarks] 慶應義塾大学 薬学部 創薬分析化学講座
  • URL: http://keio-analchem.jp/index.html
• [Remarks] 東京大学 大学院薬学系研究科 薬品代謝化学教室
  • URL: http://taisha.f.u-tokyo.ac.jp/index.html