Architecture of the transition zone separating the cytoplasm and cilioplasmand, and selective protein translocation across it

• Project Area: Toward an integrative understanding of functional zones in organelles
• Project/Area Number: 20H04904
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 中山 和久 京都大学, 薬学研究科, 教授 (40192679)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2022-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥7,150,000 (Direct Cost: ¥5,500,000、Indirect Cost: ¥1,650,000); Fiscal Year 2021: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000); Fiscal Year 2020: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000)
• Keywords: 繊毛 / タンパク質複合体 / トランジションゾーン / 繊毛病 / 繊毛内タンパク質輸送 / タンパク質間相互作用 / CRISPR/CAS9システム / トランジション・ゾーン / CRISPR/Cas9システム

Outline of Research at the Start

繊毛の基部に存在するトランジション・ゾーン（Transition Zone: TZ）は、繊毛内と細胞質を隔てる拡散障壁として機能し、繊毛へのタンパク質の選択的な出入りを制御する。本研究では、特定のタンパク質だけを選択的に通過させるTZに関して、TZ 構成タンパク質間の相互作用解析によるTZ 構築様式、およびTZ 構成タンパク質のKO 細胞や繊毛病型変異を有するノックイン（KI）細胞におけるTZ 構築の破綻機構を明らかにすることにより、繊毛病発症の分子基盤の解明を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

様々な繊毛病で見られる突然変異に関して、これらの変異によってどのようなタンパク質間相互作用が異常になるのかを明らかにし、繊毛タンパク質がトランジションゾーン（TZ）を通過する機構がどのように異常になるのかを解明することによって、繊毛病発症の分子基盤に迫った。
①　繊毛膜に局在するホスホイノシチド5-ホスファターゼであるINPP5Eが、低分子量GTPaseのARL13BとARL3の調節下で、どのようにしてTZを超えて繊毛膜に局在するようになり、繊毛膜に保持されるのかのメカニズムを明らかにした。
②　骨格形成異常を伴う繊毛病に関連して、繊毛内逆行輸送を媒介するIFT-A複合体のサブユニットIFT144、および繊毛内逆行輸送のモーターであるダイニン2複合体のサブユニットDYNC2LI1の変異に起因する繊毛病の分子レベル、および細胞レベルでの基盤を明らかにした。特に、これらの変異によって、IFT装置がTZを超えて繊毛から排出されなくなることを示した。
③　網膜変性、多指症、嚢胞腎、病的肥満などを伴う繊毛病であるバルデー・ビードル症候群（BBS）に関連して、繊毛内順行輸送を媒介するIFT-B複合体のサブユニットであるIFT27/BBS19およびIFT74/BBS22の変異に起因する分子レベル、および細胞レベルでの異常の基盤を明らかにした。特に、BBSに見られる変異によって、繊毛に局在するGPCRのTZを超える繊毛からの排出が障害されることを証明した。
④　繊毛先端でのIFT装置の順行輸送から逆行輸送への方向転換を調節するキナーゼICK/CILK1がIFT-B複合体に結合して先端へと運ばれるメカニズムを明らかにするとともに、ICK/CILK1をリン酸化することによって方向転換に関わる別のキナーゼCCRK/CDK20による方向転換の調節機構も明らかにした。

Research Progress Status

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Combinations of deletion and missense variations of the dynein-2 DYNC2LI1 subunit found in skeletal ciliopathies cause ciliary defects (2022)
  • Author(s): Qiu Hantian、Tsurumi Yuta、Katoh Yohei、Nakayama Kazuhisa
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 12 Issue: 1 Pages: 31-31
  • DOI: 10.1038/s41598-021-03950-0
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Impaired cooperation between IFT74/BBS22?IFT81 and IFT25?IFT27/BBS19 causes Bardet-Biedl syndrome (2022)
  • Author(s): Zhou Zhuang、Qiu Hantian、Castro-Araya Roiner-Francisco、Takei Ryota、Nakayama Kazuhisa、Katoh Yohei
  • Journal Title: Human Molecular Genetics Volume: 31 Issue: 10 Pages: 1681-1693
  • DOI: 10.1093/hmg/ddab354
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Molecular basis of ciliary defects caused by compound heterozygous IFT144/WDR19 mutations found in cranioectodermal dysplasia (2021)
  • Author(s): Ishida Yamato、Kobayashi Takuya、Chiba Shuhei、Katoh Yohei、Nakayama Kazuhisa
  • Journal Title: Human Molecular Genetics Volume: - Issue: 3-4 Pages: 213-225
  • DOI: 10.1093/hmg/ddab034
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ARL3 and ARL13B GTPases participate in distinct steps of INPP5E targeting to the ciliary membrane (2021)
  • Author(s): Fujisawa Sayaka、Qiu Hantian、Nozaki Shohei、Chiba Shuhei、Katoh Yohei、Nakayama Kazuhisa
  • Journal Title: Biology Open Volume: 10 Issue: 9
  • DOI: 10.1242/bio.058843
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] CCRK/CDK20 regulates ciliary retrograde protein trafficking via interacting with BROMI/TBC1D32 (2021)
  • Author(s): Noguchi Tatsuro、Nakamura Kentaro、Satoda Yuuki、Katoh Yohei、Nakayama Kazuhisa
  • Journal Title: PLOS ONE Volume: 16 Issue: 10 Pages: e0258497-e0258497
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0258497
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The interaction of ATP11C-b with ezrin contributes to its polarized localization (2021)
  • Author(s): Inoue Hiroki、Takatsu Hiroyuki、Hamamoto Asuka、Takayama Masahiro、Nakabuchi Riki、Muranaka Yumeka、Yagi Tsukasa、Nakayama Kazuhisa、Shin Hye-Won
  • Journal Title: Journal of Cell Science Volume: 134 Issue: 20
  • DOI: 10.1242/jcs.258523
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cooperation of the IFT-A complex with the IFT-B complex is required for ciliary retrograde protein trafficking and GPCR import (2021)
  • Author(s): Kobayashi Takuya、Ishida Yamato、Hirano Tomoaki、Katoh Yohei、Nakayama Kazuhisa
  • Journal Title: Molecular Biology of the Cell Volume: 32 Issue: 1 Pages: 45-56
  • DOI: 10.1091/mbc.e20-08-0556
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Interaction of INPP5E with ARL13B is essential for its ciliary membrane retention but dispensable for its ciliary entry (2021)
  • Author(s): Qiu Hantian、Fujisawa Sayaka、Nozaki Shohei、Katoh Yohei、Nakayama Kazuhisa
  • Journal Title: Biology Open Volume: 10
  • DOI: 10.1242/bio.057653
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Practical method for superresolution imaging of primary cilia and centrioles by expansion microscopy using an amplibody for fluorescence signal amplification (2020)
  • Author(s): Katoh Yohei、Chiba Shuhei、Nakayama Kazuhisa
  • Journal Title: Molecular Biology of the Cell Volume: 31 Issue: 20 Pages: 2195-2206
  • DOI: 10.1091/mbc.e20-04-0250
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Formation of the B9-domain protein complex MKS1?B9D2?B9D1 is essential as a diffusion barrier for ciliary membrane proteins (2020)
  • Author(s): Okazaki Misato、Kobayashi Takuya、Chiba Shuhei、Takei Ryota、Liang Luxiaoxue、Nakayama Kazuhisa、Katoh Yohei
  • Journal Title: Molecular Biology of the Cell Volume: 31 Issue: 20 Pages: 2259-2268
  • DOI: 10.1091/mbc.e20-03-0208
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The N- or C-terminal cytoplasmic regions of P4-ATPases determine their cellular localization (2020)
  • Author(s): Okamoto Sayuri、Naito Tomoki、Shigetomi Ryo、Kosugi Yusuke、Nakayama Kazuhisa、Takatsu Hiroyuki、Shin Hye-Won
  • Journal Title: Molecular Biology of the Cell Volume: 31 Issue: 19 Pages: 2115-2124
  • DOI: 10.1091/mbc.e20-04-0225
  • NAID: 120006951697
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Anterograde trafficking of ciliary MAP kinase?like ICK/CILK1 by the intraflagellar transport machinery is required for intraciliary retrograde protein trafficking (2020)
  • Author(s): Nakamura Kentaro、Noguchi Tatsuro、Takahara Mariko、Omori Yoshihiro、Furukawa Takahisa、Katoh Yohei、Nakayama Kazuhisa
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 295 Issue: 38 Pages: 13363-13376
  • DOI: 10.1074/jbc.ra120.014142
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Architecture of the IFT ciliary trafficking machinery and interplay between its components (2020)
  • Author(s): Nakayama Kazuhisa、Katoh Yohei
  • Journal Title: Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology Volume: 55 Issue: 2 Pages: 179-196
  • DOI: 10.1080/10409238.2020.1768206
  • Peer Reviewed
• [Presentation] PIホスファターゼINPP5Eの繊毛膜局在におけるARL13BとARL3の役割 (2021)
  • Author(s): 藤澤さやか、邱 瀚田、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第67回日本生化学会近畿支部例会
• [Presentation] 「Furin」から「膜交通」を経て「繊毛内タンパク質輸送」の研究へ：低分子量GTPaseによるナビゲーション (2021)
  • Author(s): 中山和久
  • Organizer: 第73回日本細胞生物学会大会
  • Invited
• [Presentation] CCRK/CDK20とBROMI/TBC1D32との相互作用による繊毛内タンパク質輸送の調節 (2021)
  • Author(s): 里田裕紀、野口達郎、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第73回日本細胞生物学会大会
• [Presentation] IFT144/WDR19の複合ヘテロ接合性変異に起因する繊毛病の分子基盤 (2021)
  • Author(s): 石田大和、古林拓也、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第73回日本細胞生物学会大会
• [Presentation] IFT-B繊毛内タンパク質輸送複合体のサブユニットの変異に起因する繊毛病バルデー・ビードル症候群（BBS）発症の分子基盤 (2021)
  • Author(s): 周 壮、邱 瀚田、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第73回日本細胞生物学会大会
• [Presentation] 繊毛内タンパク質輸送調節におけるCCRK/CDK20とBROMI/TBC1D32の役割 (2021)
  • Author(s): 里田裕紀、野口達郎、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第20回次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2021
• [Presentation] IFT-A複合体サブユニットIFT144の複合ヘテロ接合性変異に起因する繊毛病の分子基盤 (2021)
  • Author(s): 石田大和、古林拓也、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第20回次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2021
• [Presentation] ダイニン2 複合体中間軽鎖DYNC2LI1 の繊毛病変異に起因する繊毛内タンパク質輸送の異常の分子基盤 (2021)
  • Author(s): 邱 瀚田、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第71回日本薬学会関西支部大会
• [Presentation] DYNC2LI1の変異に起因する繊毛病の分子基盤 (2021)
  • Author(s): 邱 瀚田、鶴見 侑大、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第94回日本生化学会大会
• [Presentation] 繊毛形成と繊毛内タンパク質輸送の分子基盤 (2021)
  • Author(s): 中山和久、加藤洋平、千葉秀平
  • Organizer: 第94回日本生化学会大会
  • Invited
• [Presentation] 超解像イメージングを駆使した一次繊毛トランジション・ゾーンの構築様式の解析 (2021)
  • Author(s): 千葉秀平、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第44回日本分子生物学会年会
  • Invited
• [Presentation] 繊毛内タンパク質輸送装置と繊毛病発症の分子基盤 (2021)
  • Author(s): 加藤洋平、周 壮、中山和久
  • Organizer: 第44回日本分子生物学会年会
  • Invited
• [Presentation] 繊毛内タンパク質輸送複合体IFT-Bの変異に起因する繊毛病バルデー・ビードル症候群（BBS）発症の分子基盤 (2021)
  • Author(s): 周 壮、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 日本薬学会第141年会
• [Presentation] INPP5Eの繊毛膜への局在メカニズムの解明 (2020)
  • Author(s): 邱 瀚田, 野崎梢平, 藤澤さやか, 加藤洋平, 中山和久
  • Organizer: 第72回日本細胞生物学会大会
• [Presentation] 繊毛膜タンパク質に対する拡散障壁を構成するB9ドメインタンパク質複合体の役割 (2020)
  • Author(s): 加藤洋平, 岡崎美聖, 千葉秀平, 中山和久
  • Organizer: 第72回日本細胞生物学会大会
• [Presentation] IFT-A複合体サブユニットIFT144の変異に起因する繊毛病の分子基盤 (2020)
  • Author(s): 石田大和，古林拓也，平野友章，加藤洋平，中山和久
  • Organizer: 第72回日本細胞生物学会大会
• [Presentation] 繊毛内輸送におけるIFT-A複合体とIFT-B複合体の相互作用の役割の解明 (2020)
  • Author(s): 古林拓也, 平野友章, 加藤洋平, 中山和久
  • Organizer: 第72回日本細胞生物学会大会
• [Presentation] メンブレントラフィック研究から繊毛内タンパク質輸送研究へ：低分子量GTPaseに導かれて (2020)
  • Author(s): 中山和久
  • Organizer: 第72回日本細胞生物学会大会
  • Invited
• [Presentation] 繊毛内タンパク質輸送複合体のサブユニットIFT144の変異に伴う繊毛病の分子基盤 (2020)
  • Author(s): 石田大和、古林拓也、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第19回次世代を担う若手ファーマ・バイオフォーラム2020
• [Presentation] 繊毛先端に局在するMAPK様キナーゼICK/CILK1の繊毛内輸送機構と機能 (2020)
  • Author(s): 中村健太郎、野口達郎、加藤洋平、中山和久
  • Organizer: 第70回日本薬学会関西支部大会
• [Presentation] 繊毛病の分子基盤：タンパク質間相互作用とゲノム編集に基づく解析 (2020)
  • Author(s): 中山和久
  • Organizer: 第59回日本薬学会・日本薬剤師会・日本病院薬剤師会 中国四国支部学術大会
  • Invited