魚類の四肢再生における細胞ダイバース過程のin vivo単一細胞解析

• Project Area: Integrated analysis and regulation of cellular diversity
• Project/Area Number: 20H05024
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 田村 宏治 東北大学, 生命科学研究科, 教授 (70261550)
• Project Period (FY): 2020-11-19 – 2022-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000); Fiscal Year 2021: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000); Fiscal Year 2020: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000)
• Keywords: 器官再生 / 四肢 / ゼブラフィッシュ

Outline of Research at the Start

われわれは最近、仔魚期であればゼブラフィッシュの胸ビレ内骨格部分も再生することを発見した。胸ビレ内骨格部分は、形態こそ異なるが前肢内骨格と相同な部分であり、この小型魚類は幼生時期であれば四肢相同部分の原基を再生できるのである。この発見を受けて、本研究では魚類の胸ビレを用いて「魚類の四肢相同構造の再生における、細胞の脱分化・再分化過程を単一細胞レベルで可視化し機能解析する」ことを研究目的としている。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では魚類の胸ビレを用いて「魚類の四肢相同構造の再生における、細胞の脱分化・再分化過程を単一細胞レベルで可視化し機能解析する」ことを研究目的としており、この目的を達成するため3つの項目を設定した。そのそれぞれに関して、当該年度は以下の研究を実施した。
1．トランスクリプトーム解析
まず、遺伝子発現の変化の全体像を把握するために、組織全体のRNAseq（bulk transcriptome）解析を行った。その結果、再生前後さらに再生可能期と不可能期において、いくつかの遺伝子が特異的に発現上昇することが判明した。とくに再生可能期と不可能期において、筋肉など間充織細胞の遺伝子発現が異なることが顕著だった。そのうちの候補遺伝子いくつかについてCRISPR/Cas9系を用いたKO解析を行った。bulk transcriptome解析の結果から、間充織細胞に焦点を当ててSingle cell transcriptome解析を進めることとした。
2021年度第２回「先進ゲノム支援」に採択され、Single cell transcriptome解析が実施可能な状態となった。再生前後におけるゼブラフィッシュ胸ビレ間充織細胞の単一化実験系の構築を進めた。
2．単一細胞系譜解析系の構築
器官再生における幹細胞の生成過程において、細胞分化マーカー発現の消失と未分化マーカー出現の時系列（タイミング）の理解や、細胞分化過程における個々の細胞の特徴の時間的推移など、個々の細胞レベルでの経時観察のために、72時間にわたりゼブラフィッシュ胸ビレを蛍光顕微鏡で経時観察する実験系を構築した。麻酔方法（麻酔薬の濃度や水流速度）など至適条件の選定に困難を生じたが、長時間経時観察できる実験系を構築できた。

Research Progress Status

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Developmental independence of median fins from the larval fin fold revises their evolutionary origin. (2022)
  • Author(s): Kazuhide Miyamoto, Koichi Kawakami, Koji Tamura, Gembu Abe
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: -
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Thalidomide and its metabolite 5‐hydroxythalidomide induce teratogenicity via the cereblon neosubstrate PLZF (2021)
  • Author(s): Yamanaka Satoshi、Murai Hidetaka、Saito Daisuke、Abe Gembu、Tokunaga Etsuko、Iwasaki Takahiro、Takahashi Hirotaka、Takeda Hiroyuki、Suzuki Takayuki、Shibata Norio、Tamura Koji、Sawasaki Tatsuya
  • Journal Title: The EMBO Journal Volume: 40 Issue: 4 Pages: 1-1
  • DOI: 10.15252/embj.2020105375
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Envelopment by endothelial cells initiates translocation of avian primordial germ cell into vascular tissue (2021)
  • Author(s): Murai Hidetaka、Shibuya Minami、Kishita Ryohei、Sunase Chihiro、Tamura Koji、Saito Daisuke
  • Journal Title: Developmental Dynamics Volume: - Issue: 10 Pages: 1410-1419
  • DOI: 10.1002/dvdy.332
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Light‐induced local gene expression in primary chick cell culture system (2021)
  • Author(s): Kitajima Keiichi、Kawahira Naofumi、Lee Sang‐Woo、Tamura Koji、Morishita Yoshihiro、Ohtsuka Daisuke
  • Journal Title: Development, Growth & Differentiation Volume: 63 Issue: 3 Pages: 189-198
  • DOI: 10.1111/dgd.12721
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] ゼブラフィッシュ胸ヒレ内骨格が再生できない原因の探索と解明 (2021)
  • Author(s): 吉田渓悟、阿部玄武、田村宏治
  • Organizer: 第92回日本動物学会オンライン米子大会