ヘム酵素が生成する酸化活性種の精密構造解析

• Project Area: Non-equilibrium-state molecular movies and their applications
• Project/Area Number: 20H05452
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 杉本 宏 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 専任研究員 (90344043)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2022-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000); Fiscal Year 2021: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000); Fiscal Year 2020: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000)
• Keywords: ヘム / X線自由電子レーザー / X線結晶構造解析 / XFEL

Outline of Research at the Start

好気生物は金属タンパク質の働きによって酸素分子がもつ酸化力をうまく利用しているといえる。ヘム酵素の活性中心は酸素を結合し、高酸化状態のFe(IV)を経由して様々な酸化反応を触媒する例が多くある。ペルオキシダーゼが過酸化水素を用いて物質を酸化する際にも、Fe(III)に結合した過酸化水素のO-O結合が開裂した後に、Fe(IV)を含む2種類の酸化活性種を中間体として経由することが提案されている。しかし、従来の手法だけでは厳密にFe-Oの性質を議論することは困難であった。本課題では、分光的に捉えられているペルオキシダーゼの反応中間体について、無損傷のX線結晶回折データを取得して精密構造解析を行う。

Outline of Annual Research Achievements

ヘムタンパク質の反応中間体について、X線自由電子レーザーを用いてX線結晶回折データを取得して無損傷構造の精密解析を行うことで、従来の結晶解析や分光学法だけでは明らかにすることができなかった配位子の性質やプロトン化状態などの化学的性質を解明することを目指した。ヘム酵素であるペルオキシダーゼでは、Fe(IV)を含む酸化活性種として２種類の中間体を経由することが長年知られてきたが、分光測定でのレーザーやX線損傷に敏感なことが解析を困難にしていた。本課題では大豆由来アスコルビン酸ペルオキシダーゼ（APX）および酵母シトクロムcペルオキシダーゼ（CcP）についての反応中間体の無損傷構造解析を英国の研究グループと共同で行った。
前年度までにAPXおよびCcPの酵素の結晶をいずれもCompound IIという2つ目の反応中間状態で凍結トラップする方法を確立し、SACLAで固定ターゲット（SF-ROX）法を用いた無損傷構造解析データの収集を行ってきた。本年度はAPX結晶については分解能1.5 Aでの精密化を完了した。この分解能では水素の位置情報を直接実験的に得ることができなかったが、Fe-O結合の距離を高い精度で決定し、水素原子が結合したFe(IV)-OHの状態であると結論付けた。
CcP結晶については、分解能1.06 Aの無損傷X線回折データデータセットを用いた構造解析によって活性部位を構成する各アミノ酸の水素原子の位置についても決定し、水素結合のネットワークを明らかにした。また、Fe-O結合の結合距離を高い精度で決定し、プロトン化していないFe(IV)=O状態であると結論付けた。CcPについてはX線自由電子レーザーによるタンパク質分子の構造としては世界最高分解能での解析であり、当初の目的を達成できた。これらの成果を国際誌Angew. Chem. Int. Ed.に報告した。

Research Progress Status

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of Bristol/University of Leicester/MRC Laboratory of Molecular Biology(英国)
• [Int'l Joint Research] University of Bristol/University of Leicester(英国)
• [Journal Article] XFEL Crystal Structures of Peroxidase Compound II (2021)
  • Author(s): Kwon, H., Basran, J., Pathak, C., Hussain, M., Freeman, S. L., Fielding, A. J., Bailey, A. J., Stefanou, N., Sparkes, H. A., Tosha, T., Yamashita, K., Hirata, K., Murakami, H., Ueno, G., Ago, H., Tono, K., Yamamoto, M., Sawai, H., Shiro, Y., Sugimoto, H., Raven, E., Moody, P. C. E.
  • Journal Title: Angewandte Chemie International Edition Volume: - Issue: 26 Pages: 14578-14585
  • DOI: 10.1002/anie.202103010
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] High-resolution structural analysis of the heme proteins using neutron and XFEL crystallography (2022)
  • Author(s): Hiroshi Sugimoto
  • Organizer: 6th International Symposium of Quantum Beam Science at Ibaraki University (Online, Ibaraki)
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Hydrogen atoms in protein structure: high resolution analysis of heme enzymes (2022)
  • Author(s): Hiroshi Sugimoto
  • Organizer: SACLA User’s Meeting (Online, Sayo)
  • Int'l Joint Research / Invited