ボツリヌスHAの細胞間バリア破壊作用の分子機構と病態における意義について

• Project Area: Matrix of Infection Phenomena
• Project/Area Number: 21022027
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 藤永 由佳子 大阪大学, 微生物病研究所, 特任准教授 (60252954)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 北所 健悟 京都工芸繊維大学, 工芸科学研究所, 准教授 (60283587)
• Project Period (FY): 2009 – 2010
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2010)
• Budget Amount: ¥7,600,000 (Direct Cost: ¥7,600,000); Fiscal Year 2010: ¥3,800,000 (Direct Cost: ¥3,800,000); Fiscal Year 2009: ¥3,800,000 (Direct Cost: ¥3,800,000)
• Keywords: 微生物 / 細菌 / Caco-2 / 上皮細胞 / バリア / 生理活性

Research Abstract

ボツリヌス食中毒の発症には神経毒素が消化管から吸収され、血中に移行し末梢神経に到達することが必要である。巨大分子である神経毒素が体内に侵入する際の重要な関門は消化管粘膜バリアであるが、毒素がこのバリアを通過する機構は不明であった。我々は最近、無毒成分中のHAが強力な細胞間バリア破壊作用を持つことを発見した。
HAの本作用の分子機構を明らかにするため、本年度は、HAが認識する基質分子の探索・同定を行った。
[HAが認識する基質分子の探索・同定]
Caco-2細胞のライゼートからpull down法により、HAに結合する分子としてE-cadherinが同定された。HAはE-cadherinに特異的に結合し、N-、VE-cadherinとの相互作用は見られなかった。また結合には動物種間でも特異性があり、ヒト、マウス、ウシのE-cadherinには相互作用したが、ラット、ニワトリのE-cadherinとは相互作用しなかった。マウスとラットのキメラE-cadherinを用いた解析により、HAに対する結合性に大きく関与するのは20番目のアミノ酸残基であり、E-cadherinのtrans-dimerを形成する領域に隣接する箇所であることが明らかとなった。また、HAの作用に対して感受性のあるMDCK細胞(イヌ腎上皮由来)にラットE-cadherinを発現させることにより、HAによる上皮細胞間バリア破壊は阻害された。
以上の解析により、HAによる上皮細胞間バリア破壊にはE-cadheirnとの相互作用が必須であると結論づけられた。
また、ヒトに中毒をほとんど起こさないC型毒素のHAは、ヒトE-cadherinと相互作用せず、ヒトの上皮細胞間バリアを破壊しない。そして、B型HAと相互作用しないラットとニワトリについては、B型毒素に対する感受性が低いことが知られている。このように、HAのE-cadherinへの結合性・上皮細胞間バリア破壊活性の有無と、ボツリヌス毒素への感受性・中毒の発症例の有無との間に部分的な相関が見られることから、HAの上皮細胞間バリア破壊活性がボツリヌス中毒発症へ寄与することが示唆された。

Research Products

• [Journal Article] Botulinum HA disrupts the intercellular epithelial barrier by directly binding E-cadherin. (2010)
  • Author(s): Sugawara Y., Matsumura T, Takegahara, Y., Jin Y., Tsukasaki Y., Takeichi M., Fujinaga, Y
  • Journal Title: J.Cell Biol. Volume: 189 Pages: 691-700
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Interaction of botulinum toxin with the epithelial barrier. (2010)
  • Author(s): Fujinaga Y.
  • Journal Title: Journal of Biomedicine and Biotechnology Volume: 2010
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Interaction of botulinum toxin with the epithelial barrier. (2010)
  • Author(s): Fujinaga Y.
  • Journal Title: Journal of Biomedicine and Biotechnology 2010
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Disruption of the epithelial barrier by botulinum hemagglutinin (HA) proteins - Differences in cell tropism and the mechanism of action between HA proteins of types A or B, and HA proteins of type C. (2009)
  • Author(s): Jin, Y., Takegahara, Y., et al.
  • Journal Title: Microbiology 155 Pages: 35-45
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A novel function of botulinum toxin-associated proteins : HA proteins disrunt intestinal epithelial barrier to increase toxin absorption. (2009)
  • Author(s): Fujinaga, Y., et al.
  • Journal Title: Toxicon 54 Pages: 583-586
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ボツリヌス毒素と腸管上皮細胞バリア破壊 (2009)
  • Author(s): 藤永由佳子
  • Journal Title: 化学療法の領域 25 Pages: 745-754
• [Journal Article] 水際の攻防～ボツリヌス毒素vs腸管上皮細胞バリア (2009)
  • Author(s): 藤永由佳子
  • Journal Title: 細胞の化学 遺伝 63 Pages: 20-25
• [Presentation] Food-borne botulism and transepithelial transport of botulinum toxin (2010)
  • Author(s): Yukako Fujinaga, Yo Sugawara, Takuhiro Matsumura, Yuki Takegahara
  • Organizer: 第62回 日本細胞生物学会(シンポジウム)シンポジウム3 病態の理解に向けた細胞内ロジスティクス研究
  • Place of Presentation: 大阪(招待講演)
• [Presentation] ボツリヌス毒素複合体成分とE-cadherinの結合による上皮細胞間バリア破壊と毒素の腸管吸収 (2010)
  • Author(s): 藤永由佳子、菅原庸、松村拓大
  • Organizer: 第33回日本分子生物学会年回・第83回日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
• [Presentation] Botulinum hemagglutinin targets E-cadherin to disrupt the intercellular epithelial barrier. (2010)
  • Author(s): Sugawara Y, Matsumura T, Takegahara T, Jin Y, Fujinaga Y.
  • Organizer: The Awaji International Forum on Infection and Immunity
  • Place of Presentation: Awaji Island, Japan
• [Presentation] Botulinum HA targets E-cadherin to disrupt the intercellular epithelial barrier. (2010)
  • Author(s): Sugawara Y, Matsumura T, Fujinaga, Y.
  • Organizer: 47^<th> IBRCC 2010, Intergency botulinum research coordinating committee meeting
  • Place of Presentation: Atlanta, USA
• [Presentation] Development of human monoclonal antibodies against type Abotulinum neurotoxin. (2010)
  • Author(s): Matsumura T, Du A, Sugawara Y, Kohda T, Takahashi M, Kozaki S, Ikuta K, Fujinaga Y.
  • Organizer: 47^<th> IBRCC 2010, Intergency botulinum research coordinating committee meeting
  • Place of Presentation: Atlanta, USA
• [Presentation] Reconstitution and dissection of epithelial barrier disrupting activity of type B botulinum HA. (2010)
  • Author(s): 竹ヶ原夕紀、菅原庸、松村拓大、藤永由佳子
  • Organizer: 第83回日本細菌学会総会
  • Place of Presentation: 横浜
• [Presentation] ボツリヌスHAは上皮細胞バリア破壊因子である (2009)
  • Author(s): 竹ヶ原夕紀、菅原庸、松村拓大、藤永由佳子
  • Organizer: 第62回日本細菌学会関西支部会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 2009-11-14
• [Presentation] Structure and function of hemagglutinin from Clostridium botulinum. (2009)
  • Author(s): Kitadokoro, K., Takegahara, Y., Karatani, H., Fujinaga, Y.
  • Organizer: The 9^<th> Awaji International Forum on Infection and Immunity.
  • Place of Presentation: 淡路島
• [Presentation] 上皮細胞バリア破壊因子botulinum HAのサブユニット機能解析 (2009)
  • Author(s): 竹ヶ原夕紀、菅原庸、松村拓大、藤永由佳子
  • Organizer: 第82回日本生化学大会
  • Place of Presentation: 神戸
• [Presentation] Mechanism for Epithelial Barrier Disruption by Botulinum HA (2009)
  • Author(s): Takegahara, Y., Matsumura, T., Sugawara, Y., Fujinaga, Y.
  • Organizer: Etox 14 (European Workshop on Bacterial Protein Toxins)
  • Place of Presentation: Obemai, France
• [Presentation] Disruption of the Epithelial Barrier by Botulinum Hemagglutinin (HA)(招待講演) (2009)
  • Author(s): Yukako Fujinaga
  • Organizer: Third Annual Botulinum Research Symposium
  • Place of Presentation: Dartmouth, USA