蛍光相関分光法を用いたプロテアソームの時空間的制御機構の解析

• Project Area: Proteolysis in the Regulation of Biological Processes
• Project/Area Number: 21025038
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 白 燦基 独立行政法人理化学研究所, 佐甲細胞情報研究室, 協力研究員 (20374655)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐伯 泰 (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 主席研究員 (80462779)
• Project Period (FY): 2009 – 2010
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2010)
• Budget Amount: ¥6,400,000 (Direct Cost: ¥6,400,000); Fiscal Year 2010: ¥3,200,000 (Direct Cost: ¥3,200,000); Fiscal Year 2009: ¥3,200,000 (Direct Cost: ¥3,200,000)
• Keywords: プロテアソーム / ユビキチン / タンパク質分解 / 生細胞イメージング / 26S複合体 / 酵母 / 核移行 / 細胞質と核 / 蛍光相関分光法 / 絶対濃度 / 拡散定数 / 相互作用 / 温度感受性

Research Abstract

本年度の研究課題は,主に蛍光相関分光法(FCS)および蛍光相互相関分光法(FCCS)を用いて生細胞内のプロテアソーム複合体の状態と会合の場(細胞質と核との比較)を明らかにすることである。そのため、変異株と阻害剤を用いて生理的条件を変えながら、26S複合体の会合と動態の状態を解析した。詳細は以下の通りである。
1.蛍光蛋白質融合株並びに薬剤感受性株(δpdr)を用いた薬剤によるプロテアソームの質的・量的変化の追跡
細胞内における26Sの遅い拡散成分の原因を調べるため(H21年度研究実績報告書参照)、蛋白質分解、細胞骨格、転写活性、脱アセチル化を阻害する薬剤をそれぞれ処理した細胞を用いて遅い拡散成分の変化を追跡した。その結果、蛋白質分解阻害剤(MG132)特異的に遅い拡散成分の割合が大幅に減ることを見出した。それに対して細胞骨格阻害については変化が見られなかった。
2.プロテアソームの会合の場と核移行
FCCS解析によりCPとlid(CPとBase)は細胞質と核内両方においてそれぞれ強く結合していることが明らかになり、サブユニットは殆どが26S複合体として存在していることが示唆された。一方,プロテアソームの核移行に欠損を示すインポーティン変異株(srpl-49)においても細胞質ではCPとlid(CPとBase)が野生型の株と同様強く結合していることが分かった。さらに、サブユニット融合型26Sプロテアソームを発現する変異株を用いた実験においても野生株と同様な局在を示した。以上の細胞計測結果から26Sプロテアソームは生細胞において細胞質で26Sとして完成し、そのまま核膜を通過できると言った新知見が示唆された。

Research Products

• [Journal Article] Single-particle tracking of quantum dot-conjugated prion proteins inside yeast cells (2011)
  • Author(s): Tsuji T., et al.
  • Journal Title: Biochem.Biophys.Res.Commun. Volume: (In press)
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] In vivo evidence for the fibrillar structures of Sup35 prions in yeast cells (2010)
  • Author(s): Kawai-Noma S., et al.
  • Journal Title: J.Cell Biol. Volume: 190 Pages: 223-231
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Biocompatible nano-agent for diffusional analysis in living cells (2010)
  • Author(s): Back C.G.
  • Journal Title: Proceedings of Asian Pacific Laser Symposium Volume: 9 Pages: 107-107
• [Journal Article] Crystal structure of yeast Rpn14, a chaperone of the 19S regulatory particle of the proteasome (2010)
  • Author(s): Kim, S., et al.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. Volume: 285 Pages: 15159-15166
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Pho85 kinase, a cyclin-dependent kinase, regulates nuclear accumulation of the Rim101 transcription factor in the stress response of Saccharomyces cerevisiae (2010)
  • Author(s): Nishizawa, M., et al.
  • Journal Title: Eukaryot.Cell Volume: 9 Pages: 943-951
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Dissection of the assembly pathway of the proteasome lid in Saccharomyces cerevisiae (2010)
  • Author(s): Fukunaga, K., et al.
  • Journal Title: Biochem.Biophys.Res.Commun. Volume: 396 Pages: 1048-1053
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Polyubiquitin conjugation to NEMO by tripartite motif protein 23 (TRIM23) is critical in antiviral defense (2010)
  • Author(s): Arimoto, K.I., et al.
  • Journal Title: Proc.Natl.Acad.Sci.USA. Volume: 107 Pages: 15856-15861
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Single mother-daughter pair analysis to clarify the diffusion properties of yeast prion Sup35 in guanidine-HCl treated[PSI+]cells (2009)
  • Author(s): Kawai-Noma S., Pack C.Gの, 他3名
  • Journal Title: Genes to Cells 14 Pages: 1045-1054
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Sharpin is a component of the NF-κB activating linear ubiquitin chain assembly complex.
  • Author(s): Tokunaga, M., et al.
  • Journal Title: Nature Volume: (In press)
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Assembly, structure, and function of the 26S proteasome. (2011)
  • Author(s): Saeki Yasushi
  • Organizer: Korea-Japan Symposium on Protein Metabolism
  • Place of Presentation: Seoul/Korea
  • Year and Date: 2011-01-28
• [Presentation] 26Sプロテアソームはどこで完成するか? (2010)
  • Author(s): 佐伯泰
  • Organizer: BMB2010(第33回分子生物学会、第83回日本生化学会合同年会)
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2010-12-09
• [Presentation] FCS並びにFCCSから見えたErbBシグナル伝達におけるShcとPI3Kの独立的反応 (2010)
  • Author(s): 白燦基
  • Organizer: 第7回バイオオプティクス研究会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2010-12-04
• [Presentation] Independent response of Shc and PI3K to ErbB signals suggested by FCS and FCCS in living cells (2010)
  • Author(s): 白燦基
  • Organizer: 第47回日本生物物理学会
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2010-09-21
• [Presentation] 26Sプロテアソームの分子集合と作動原理 (2010)
  • Author(s): 佐伯泰
  • Organizer: 第19回酵母合同シンポジウム
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2010-06-24
• [Presentation] Spatio-temporal analysis of nuclear microenvironment using oligomer GFP and fluorescent nano-particles (2010)
  • Author(s): 白燦基
  • Organizer: 第9回核ダイナミクス研究会
  • Place of Presentation: 伊豆市
  • Year and Date: 2010-05-28
• [Presentation] Interaction network of diffusive proteins in ErbB signaling of living cells (2010)
  • Author(s): 白燦基
  • Organizer: 第62回日本細胞生物学会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 2010-05-19
• [Presentation] Biocompatible nano-agent for diffusional analysis in living cells (2010)
  • Author(s): 白燦基
  • Organizer: The 7^<th> Asian Pacific Laser Symposium
  • Place of Presentation: Jeju Island/Korea
  • Year and Date: 2010-05-13
• [Presentation] Understanding of ErbB signaling network by diffusion and interaction analysis of proteins in living cells (2009)
  • Author(s): 白燦基の, 他3名
  • Organizer: 第47回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 徳島文理大学(徳島県)
  • Year and Date: 2009-11-01
• [Presentation] Quantification of interplay of HSF1, HSF2, and HSF4 molecules in live cell through analysis of diffusion and interaction (2009)
  • Author(s): Back C.G.
  • Organizer: The 4^<th> International Congress on Stress Response in Biology and Medicine
  • Place of Presentation: Sapporo, Hokkaido
  • Year and Date: 2009-10-07
• [Book] 実験医学・増刊号「細胞内分解系によるリノベーションの分子機構に迫る」 (2011)
  • Author(s): 佐伯泰
  • Publisher: 羊土社(印刷中)
• [Book] Methods in Molecular Biology (Ubiquitin family modifiers and the proteasome) (2011)
  • Author(s): Saeki, Y.
  • Publisher: Humana Press(In press)
• [Book] 日本臨牀 分子標的薬治療 (2010)
  • Author(s): 佐伯泰
  • Total Pages: 6
  • Publisher: 日本臨牀社
• [Remarks] 東京都臨床医学総合研究所
  • URL: http://www.rinshoken.or.jp/MO/index.html