少数のアミノ酸置換による蛋白質の主鎖構造の揺らぎの設計法の開発及びその効果の解析

• Project Area: Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions
• Project/Area Number: 21107505
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology
• Principal Investigator: 黒田 裕 東京農工大学, 大学院・工学研究院, 准教授 (10312240)
• Project Period (FY): 2009 – 2010
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2010)
• Budget Amount: ¥6,760,000 (Direct Cost: ¥5,200,000、Indirect Cost: ¥1,560,000); Fiscal Year 2010: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000); Fiscal Year 2009: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000)
• Keywords: 蛋白質 / 生物物理 / 構造安定性 / 熱力学解析 / 変異体解析

Research Abstract

本研究では、1または少数アミノ酸置換が引き起こす揺らぎを設計し、その効果を、BPTI-[5,55](58残基)とデングウイルス由来D蛋白質の第3ドメイン(E3D;96残基)などのモデル蛋白質を用いて実験的に調べることを目的とする。
平成22年度では、BPTI-[5,55]の14番と38番の残基を中心とするトリプシン結合部位が座位するループ領域の主鎖構造の揺らぎがBPTI-[5,55]の安定性に及ぼす影響を調べた。そのため、14番と38番目の残基をそれぞれ、Gly,Ala,Valに置換した9種類の変異体と合わせて、14Gly38Ileと14Gly38Lysの合計11種類の変異体を発現・精製し、全変異体の熱安定性を円二色性分光法(CD)及び示差走査型熱量計(DSC)を用いてその熱力学パラメータを測定した。さらに、エンタルピー的に熱安定性が高かった5種類の変異体の立体構造をX線結晶構造解析法を用いて決定し、温度因子や主鎖の局所的な構造変形から揺らぎを評価した(座標はPDB登録済み)。また、実験技術において、少数アミノ酸置換した変異体の容易な結晶化法として、ヘテロシーディング法を立案し、その有効性を本研究で、初めて示したと考えている(ヘテロシーディング法:不安定な変異体の結晶化に安定な変異体を用いて作った結晶の核を用いる手法)。
さらに、E3Dにおいても同様の実験を行い、デングウイルス3型及び4型由来の合計2種類のE3DのX線結晶構造を決定し、CDでその熱安定性を求めた(座標はPDB仮登録中)。本件において、今後は、各デングウイルス型におけるE3Dの熱安定性及び抗体認識部位の揺らぎが抗体結合力に及ぼす影響の詳細を解析する予定である。

Research Products

• [Journal Article] DROP : an SVM domain linker predictor trained with optimal features selected by random forest (2011)
  • Author(s): Ebina Teppei, Toh Hiroyuki, Kuroda Yutaka
  • Journal Title: Bioinformatics Volume: 27(4) Pages: 487-494
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Prediction of protein motions from amino acid sequence and its application to protein-protein interaction (2010)
  • Author(s): Shuichi Hirose, Kiyonobu Yokota, Yutaka Kuroda, Hiroshi Wako, Shigeru Endo, Satoru Kanai, Tamotsu Noguchi
  • Journal Title: BMC Structural Biology Volume: 10 Pages: 20-20
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Biophysical characterization of highly active recombinant Gaussia luciferase expressed in Escherichia coli (2010)
  • Author(s): Rathnayaka Tharangani, Tawa Minako, Sohya Shihori, Yohda Masafumi, Kuroda Yutaka
  • Journal Title: Biochim Biophys Acta Volume: 1804(9) Pages: 1902-1907
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mathematical Model for Empirically Optimizing Large Scale Production of Soluble Protein Domains (2010)
  • Author(s): Eisuke Chikayama, Atsushi Kurodani, Takanori Tanaka, Takashi Yabuki, Satoshi Miyazaki, Shigeyuki Yokoyama, Yutaka Kuroda
  • Journal Title: BMC Bioinformatics Volume: 11 Pages: 113-113
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ジュネーブ・Swiss-Protグループの紹介 (2010)
  • Author(s): 黒田裕, Lieberherr Damien
  • Journal Title: 生物物理 Volume: 50(5) Pages: 252-253
  • NAID: 10026670731
• [Journal Article] Mathematical Model for Empirically Optimizing Large Scale Production of Soluble Protein Domains (2010)
  • Author(s): Chikayama Eisuke, Kurotani Atsushi, Tanaka Takanori, Yabuki Takashi, Miyazaki Satoshi, Yokoyama Shigeyuki, Kuroda Yutaka
  • Journal Title: BMC Bioinformatics 11 Pages: 113-113
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Thermodynamic and structural analysis of highly stabilizing single and double mutations in BPTI variants (2009)
  • Author(s): Islam M Mohammad, Shihori Sohya, Keiichi Noguchi, Shun-Ichi Kidokoro, Masafumi Yohda, Yutaka Kuroda
  • Journal Title: PROTEINS 77 Pages: 962-970
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Improved protein splicing reaction for low solubility protein fragments without insertion of native extein residues(NERs) (2009)
  • Author(s): Kamioka Tetsuya, Tawa Minako, Sohya Shihori, Yamazaki Toshio, Kuroda Yutaka
  • Journal Title: Biopolymers(Peptide Science) 92(5) Pages: 465-470
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 蛋白質の構造形成に必要な最小情報とは―単純化ウシ膵臓トリプシン阻害蛋白質変異体構造と熱力学― (2009)
  • Author(s): 加藤淳、イスラムMモハマド、黒田裕
  • Journal Title: 蛋白質 核酸 酵素 54(5) Pages: 643-648
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Loop-length dependent SVM prediction of domain linkers for high-throughput structural proteomics (2009)
  • Author(s): Ebina Teppei, Toh Hiroyuki, Kuroda Yutaka
  • Journal Title: Biopolymers 92 Pages: 1-8
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Stabilization of BPTI-[5,55] through decrease of Iocal backbone fluctuations and development of hetero-microseeding for crystallizing low-stability proteins (2010)
  • Author(s): Yutaka Kuroda, Mohamed M Islam, Kei Kobayashi
  • Organizer: 揺らぎが機能を決める生命分子の科学 第4回公開シンポジウム
  • Place of Presentation: 滋賀県立県民交流センターピアザ淡海(滋賀県)
  • Year and Date: 2010-11-30
• [Presentation] Thermally Stabilized Green Fluorescent Protein : Experimental and Theoretical Analyses (2010)
  • Author(s): 秋山沙織、末永敦、小林貴幸、上岡哲矢、泰地真弘人、黒田裕
  • Organizer: 第48回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 東北大学(宮城県)
  • Year and Date: 2010-09-22
• [Presentation] 1及び2残基置換によって熱安定化したBPTI変異体の実験的解析 (2010)
  • Author(s): 小林慶、イスラムモニルモハマド、野口恵一、城所俊一、養王田正文、黒田裕
  • Organizer: 第48回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 東北大学(宮城県)
  • Year and Date: 2010-09-22
• [Presentation] Analysis of Three-Residue Fragment's Conformational Space (2010)
  • Author(s): 木村俊太、蝦名鉄平、町田惠久海、黒田裕
  • Organizer: 第48回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 東北大学(宮城県)
  • Year and Date: 2010-09-21
• [Presentation] Biophysical Characterization of highly active recombinant Gaussia luciferase expressed in Escherichia coli (2010)
  • Author(s): Tharangani Rathnayaka, Minako Tawa, Shihori Sohya, Masafumi Yohda, Yutaka Kuroda
  • Organizer: 第48回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 東北大学(宮城県)
  • Year and Date: 2010-09-20
• [Presentation] 短いペプチドの新しい溶解度測定法の開発 (2010)
  • Author(s): 島田広海、モハマドモニルイスラム、モンスルアラムカーン、辻良太郎、黒田裕
  • Organizer: 第48回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 東北大学(宮城県)
  • Year and Date: 2010-09-20
• [Presentation] Purification of Recombinant Protein using Cell Wall Breakage by co-Expression of VanX (2010)
  • Author(s): 上岡哲矢、惣谷志保里、黒田裕
  • Organizer: 第48回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 東北大学(宮城県)
  • Year and Date: 2010-09-20
• [Presentation] ドメインリンカーの構造と配列が構造ドメイン形成に及ぼす影響 (2010)
  • Author(s): 蝦名鉄平、岩崎駿、黒田裕
  • Organizer: 第48回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 東北大学(宮城県)
  • Year and Date: 2010-09-20
• [Presentation] Analysis of Three-Residue Fragment's Conformational Space (2010)
  • Author(s): Shunta Kimura, Teippei Ebina Yutaka Kuroda
  • Organizer: Computational Biology Research Center Workshop 2010
  • Place of Presentation: 産業技術総合研究所(東京都)
  • Year and Date: 2010-07-28
• [Presentation] Effect of Short Peptide Tags On Protein Solubility, Function, Structure Studied in the context of BPTI (2010)
  • Author(s): Mohammad Monirul Islam, Keiichi Noguchi, Masafumi Yohda, Yutaka Kuroda
  • Organizer: 第10回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター(北海道)
  • Year and Date: 2010-06-16
• [Presentation] Effect of short tags on protein solubility, function and structure (2010)
  • Author(s): Mohammad Monirul Islam, Keiichi Noguchi, Masafumi Yohda, Yutaka Kuroda
  • Organizer: The Role of Biochemists in Health and Environment, Graduate Biochemists Association
  • Place of Presentation: University of Dhaka (Dhaka, Bangladesh)
  • Year and Date: 2010-05-21
• [Presentation] X-Ray Crystal Structures of Extensively Simplified BPTI Variants Determined Using the KEK Photon Factory Facility (2010)
  • Author(s): イスラムMモハマド、惣谷志保里、野口恵一、養王田正文、黒田裕
  • Organizer: First Asia-Europe Physics Summit
  • Place of Presentation: エポカルつくば(茨城県)
  • Year and Date: 2010-03-24
• [Presentation] An SVM-Domain Linker Prediction Trained with Optimized Features Selected Random Forest and Stepwise Selection (2010)
  • Author(s): Ebina Teppei, Toh Hiroyuki, Kuroda Yutaka
  • Organizer: First Asia-Europe Physics Summit
  • Place of Presentation: エポカルつくば(茨城県)
  • Year and Date: 2010-03-24
• [Presentation] Further Simplification of the BPTI Sequence : Minimum Information for Specifying a Native Protein Structure (2009)
  • Author(s): 黒田裕, イスラムMモハマド, 惣谷志保里, 野口恵一, 養王田正文、
  • Organizer: 第2回日韓生体分子科学セミナー「実験とシミュレーション」
  • Place of Presentation: 名古屋大学(愛知県)
  • Year and Date: 2009-12-22
• [Presentation] 超単純化BPTIに於ける揺らぎ～X線結晶構造解析を用いた分子レベルでの解明～(Molecular Fluctuations in Extensively Simplified BPTI Variants Examined by X-ray Crystallography) (2009)
  • Author(s): 黒田裕、イスラムMモハマド
  • Organizer: 新学術領域研究「揺らぎと生体機能」第3回公開シンポジウム
  • Place of Presentation: 名古屋大学(愛知県)
  • Year and Date: 2009-12-20
• [Presentation] MOBILITY OF WATER MOLECULES INTO GFP INTERIOR AND THEIR EFFECTS ON THE THERMAL STABILITY (2009)
  • Author(s): 秋山沙織, 小林貴幸, 上岡哲矢, 末永敦, 泰地真弘人, 黒田裕
  • Organizer: 第32回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(神奈川県)
  • Year and Date: 2009-12-12
• [Presentation] 短い溶解度向上ペプチドタグ(SEPタグ)による新規封入体形成抑制法の開発 (2009)
  • Author(s): 石原謙一郎, 惣谷志保里, 黒田裕
  • Organizer: 第32回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(神奈川県)
  • Year and Date: 2009-12-10
• [Presentation] E.coli expression of soluble and active Gaussia luciferase (2009)
  • Author(s): Tharangani Rathnayaka, Makino Erika, Sohya Shihori, Yohda Masafumi, Kuroda Yutaka
  • Organizer: 第32回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(神奈川県)
  • Year and Date: 2009-12-10
• [Presentation] 点変異によって13度熱安定化したBPTI変異体の構造及び熱安定性の解析 (2009)
  • Author(s): イスラムMモハマド、惣谷志保里、野口恵一、城所俊一、養王田正文、黒田裕
  • Organizer: 第47回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: アクティとくしま(徳島県)
  • Year and Date: 2009-11-01
• [Presentation] 最適化された記述子群を用いたドメインリンカー予測法の開発 (2009)
  • Author(s): 蝦名鉄平、藤博幸、黒田裕
  • Organizer: 第47回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: アクティとくしま(徳島県)
  • Year and Date: 2009-10-31
• [Presentation] BPTI変異体の熱安定性とタンパク質間相互作用の共進化的視点からの解析シンポジウム タンパク質間相互作用研究の手法としての共進化解析 (2009)
  • Author(s): 黒田裕
  • Organizer: 第47回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: アクティとくしま(徳島県)
  • Year and Date: 2009-10-30
• [Presentation] アミノ酸配列単純化法を用いたBPTI蛋白質の構造形成及び熱安定性の解析 (2009)
  • Author(s): 黒田裕、イスラムMモハマド
  • Organizer: 第82回日本生化学会年会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド(兵庫県)
  • Year and Date: 2009-10-24
• [Book] 邦訳:「物理化学で用いられる量・単位・記号要約版 (2010)
  • Author(s): 朽津耕三、黒田裕、志田忠正
  • Total Pages: 11
  • Publisher: 日本化学会 グリーンブック要約版・訳書作成委員会
• [Remarks] The first prize for the poster (Best poster賞)受賞
• [Remarks] Islam Monirul Islam, Keiichi Noguchi, Masafumi Yohda, Kuroda Yutaka, "Effect of short peptide tags on protein solubility, function, and structure" Symposium on the Role of Biochemists in Health and Environment, Dhaka, Bangladesh, May 21, 2010