新しいタイプの天然変性蛋白質の揺らぎと機能の解明

• Project Area: Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions
• Project/Area Number: 21107506
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: University of Toyama
• Principal Investigator: 水口 峰之 富山大学, 大学院・医学薬学研究部(薬学), 教授 (30332662)
• Project Period (FY): 2009 – 2010
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2010)
• Budget Amount: ¥7,280,000 (Direct Cost: ¥5,600,000、Indirect Cost: ¥1,680,000); Fiscal Year 2010: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000); Fiscal Year 2009: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
• Keywords: 天然変性蛋白質 / タンパク質 / ポリグルタミン / NMR / クンパク質

Research Abstract

U5-15kDの^<15>N/^<13>Cラベル体についてCBCANH等のNMRスペクトルを測定し主鎖の帰属を行った。
U5-15kDの^<15>Nラベル体に対して非標識のPQBP-1C末端ドメイン(CTD)を滴定し、^1H-^<15>N HSQCスペクトルを測定した。CTD結合によるU5-15kDのケミカルシフト変化とピーク強度変化を調べた。その結果、PQBP-1 CTDは241-264残基でU5-15kDに結合していることが示された。
PQBP-1のC末端ドメインにシステイン残基を導入し、常磁性標識試薬MTSLでラベルした。MTSLでPQBP-1のCys 241とCys 264をそれぞれラベルしたサンプルを準備し、U5-15kDと結合したときの変化を^1H-^<15>N HSQCによって検出した。MTSL標識PQBP-1は^<15>Nラベル体、U5-15kDは非標識体を用いた。PQBP-1 CTDの^1H-^<15>N HSQCを測定すると、U5-15kDの結合にともなって新しいピークが出現するが、これらの結合状態のピークがMTSLの近傍に位置していることがわかった。この実験結果もPQBP-1のU5-15kD結合領域が241-264残基であることを示唆している。
FRET (fluorescence resonance energy transfer)を使って、PQBP-1とCTDの相互作用を解析した。MTSLの場合と同様に、システインを導入したC末端ドメインを準備しIAEDANSでラベルした。また、U5-15kDにはTrpが3つあるが、Trpが1つのU5-15kD変異体を3種類準備した。U5-15kDのTrp変異体とC末端ドメインのIAEDANSラベル体を使ってFRETを測定した。

Research Products

• [Journal Article] Polyglutamine tract-binding protein-1 binds to U5-15kD via a continuous 23-residue segment of the C-terminal domain. (2010)
  • Author(s): Takahashi, M., et al.
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics Volume: 1804 Pages: 1500-1507
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 天然変性タンパク質PQBP-1の揺らぎと生体機能 (2010)
  • Author(s): 水口峰之, 岡澤均
  • Journal Title: メディカルバイオ Volume: 10月号別冊 Pages: 44-48
• [Journal Article] Polylutamine tract binding protein-1 is an intrinsically unstructured protein. (2009)
  • Author(s): Takahashi, M., et al.
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics 1794 Pages: 936-943
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A novel β-defensin structure : big defensin changes its N-terminal structure to associate with the target membrane. (2009)
  • Author(s): Kouno, T., et al.
  • Journal Title: Biochemistry 48 Pages: 7629-7635
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Fluctuation and function of polyglutamine tract binding protein-1. (2009)
  • Author(s): Mizuguchi, M., Takahashi, M., Okazawa, H., Kawano, K.
  • Organizer: The 3rd International Symposium on Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions
  • Place of Presentation: Nagoya University
  • Year and Date: 2009-12-21