AFMを用いた機械的伸張法によるタンパク質の揺らぎの検出と生物学的機能との関連

• Project Area: Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions
• Project/Area Number: 21107507
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Japan Advanced Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 川上 勝 北陸先端科学技術大学院大学, マテリアルサイエンス研究科, 講師 (70452117)
• Project Period (FY): 2009 – 2010
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2010)
• Budget Amount: ¥7,020,000 (Direct Cost: ¥5,400,000、Indirect Cost: ¥1,620,000); Fiscal Year 2010: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000); Fiscal Year 2009: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000)
• Keywords: 原子間力顕微鏡 / 1分子 / フォールディング / Halotagタンパク質 / ミオグロビン / 揺らぎ / タンパク質 / 生物物理 / 1分子測定

Research Abstract

蛋白質やその複合体は力学的刺激に対して構造を保持、または構造を変化(アンフォールディング過程を含む)させるが、これは細胞にとって外的刺激を信号として伝達する非常に重要な機能である。近年の研究により、タンパク質の力学的安定性はトポロジーだけでなく、側鎖のパッキング、特に疎水性コアの形成に関係していることが指摘されてきている。本年度の研究では1分子力学測定を、より多くの生物学的に重要なタンパク質へ応用できるよう、タンパク質の1分子固定化方法を開発した。具体的には、従来基板表面へのタンパク質の部位固定化には、タンパク質内のシステイン残基のチオール基を利用した共有結合を利用していたが、この方法ではシステインを多く含むタンパク質では多くの個所で基板へ固定化され、部位特異的な固定が出来ない。そこでチオール基に頼らない方法として、全く別の共有結合であるHalotagタンパク質を目的分子のN末端部へ導入し、基板へ固定したHalotag分子との共有結合により、目的分子を含むHalotagキメラ分子を固定化することに成功した。Halotagタンパク質の力学的特性も明らかにし、目的分子との信号の区別化を行った。
さらに22年度内には、ミオグロビンを対象とし、1分子力学実験が可能となるよう、タンパク質の調整を行った。
力学的特性が良く調べられたTitinをハンドル分子とし、ミオグロビンを挟む形でタンパク質を発現調整したところ、基板への部位固定化、そしてAFMによる1分子伸長実験データが取得できた。これによりミオグロビンの力学特性、ダイナミクス研究を行う可能性を明らかにした。

Research Products

• [Journal Article] Application of HaloTag protein to covalent immobilisation of recombinant proteins for single molecule force spectroscopy (2010)
  • Author(s): Yukinori Taniguchi, Masaru Kawakami
  • Journal Title: Langmuir Volume: 26 Pages: 10433-10436
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Dynamics of the coiled-coil unfolding transition of myosin rod probed by dissipation force spectrum (2010)
  • Author(s): Yukinori Taniguchi, Bhavin S.Khatri, David J.Brockwell, Emanuele Paci, Masaru Kawakami
  • Journal Title: Biophysical Journal Volume: 99 Pages: 257-262
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Reduction of the Damping on an AFM Cantilever in Fluid by the Use of Micro Pillar Stage (2010)
  • Author(s): Masaru Kawakami
  • Journal Title: Langmuir 26 Pages: 1002-1007
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Identification of a Mechanical Rheostat in Hydrophobic Core of Protein L (2009)
  • Author(s): David P.Sadler
  • Journal Title: Journal of Molecular Biology 393 Pages: 237-248
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Mechanical Stability of proteins probed by Atomic Force Microscopy (2011)
  • Author(s): Masaru Kawakami
  • Organizer: CNSI-JAIST Workshop
  • Place of Presentation: CNSI, UCLA, USA
  • Year and Date: 2011-01-13
• [Presentation] AFMによる1分子タンパク質ダイナミクス研究の現状と問題点 (2010)
  • Author(s): 川上勝
  • Organizer: BNM(DFSを考える会)
  • Place of Presentation: (財)新世代研究所(東京)(招待講演)
  • Year and Date: 2010-11-16
• [Presentation] Energy Landscape of Single Protein Molecules Studied by Mechanical Unfolding Experiments (2010)
  • Author(s): Yukinori Taniguchi, Akiko Kobayashi, Masaru Kawakami
  • Organizer: Indo-Japan Joint Workshop on "New Frontiers of Molecular Spectroscopy ; from Gas Phase to Proteins"
  • Place of Presentation: 六甲荘(神戸)(招待講演)
  • Year and Date: 2010-09-27
• [Presentation] カラー3Dプリンタを利用した新しい生体分子模型の開発 (2010)
  • Author(s): 川上勝
  • Organizer: 第10回国際バイオEXPO
  • Place of Presentation: 東京ビッグサイト(東京)
  • Year and Date: 2010-07-02
• [Presentation] DFSによるタンパク質ダイナミクス研究の現状と課題点 (2010)
  • Author(s): 川上勝
  • Organizer: 2nd Bio-Nano Mechanics生体分子間相互作用の力学計測研究会
  • Place of Presentation: 財団法人新世代研究所(東京)
  • Year and Date: 2010-03-11
• [Presentation] Dynamic Force Spectroscopy Reveals the Fluctuation of Protein Molecules (2010)
  • Author(s): Masaru Kawakami
  • Organizer: CNSI-JAIST Workshop
  • Place of Presentation: JAIST (Ishikawa, Japan)
  • Year and Date: 2010-01-18
• [Presentation] 生体1分子の粘弾性測定 (2010)
  • Author(s): 川上勝
  • Organizer: 167委員会
  • Place of Presentation: 大阪大学銀杏会館(大阪)
  • Year and Date: 2010-01-07
• [Presentation] Exploring the Energy Landscape of Single Protein Molecules by Mechanical Unfolding Experiments (2009)
  • Author(s): Masaru Kawakami
  • Organizer: The 3^<rd> International Symposium on "Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions"
  • Place of Presentation: Toyoda Auditorium, Nagoya University (Aichi)
  • Year and Date: 2009-12-20
• [Presentation] Dynamic Force Spectroscopyによるタンパク質フォールディング研究 (2009)
  • Author(s): 川上勝
  • Organizer: ATI「DFSを考える」研究会
  • Place of Presentation: 財団法人新世代研究所(東京)
  • Year and Date: 2009-11-26
• [Presentation] Quantitative Detection of the Fluctuation of Proteins with AFM (2009)
  • Author(s): Masaru Kawakami
  • Organizer: 第47回生物物理学会年会
  • Place of Presentation: アスティ徳島(徳島)
  • Year and Date: 2009-10-31
• [Remarks]
  • URL: http://www.jaist.ac.jp/ms/labo/kawakamim.html
• [Remarks]
  • URL: http://www.jaist.ac.jp/profiles/info.php?profile_id=00486
• [Remarks]
  • URL: http://www.jaist.ac.jp/ms/labo/kawamim.html
• [Remarks]
  • URL: http://www.jaist.ac.jp/profiles/info.php?profile_id=00486