一分子蛍光計測による膜タンパク質構造形成過程の揺らぎ解析

• Project Area: Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions
• Project/Area Number: 21107514
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 矢野 義明 京都大学, 薬学研究科, 助教 (60402799)
• Project Period (FY): 2009 – 2010
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2010)
• Budget Amount: ¥6,890,000 (Direct Cost: ¥5,300,000、Indirect Cost: ¥1,590,000); Fiscal Year 2010: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000); Fiscal Year 2009: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000)
• Keywords: 1分子計測 / 膜タンパク質 / 膜貫通ヘリックス / 蛍光励起エネルギー移動 / コレステロール / 揺らぎ

Research Abstract

これまでに確立した膜貫通ヘリックス会合の一分子計測条件を元に、さらに条件を最適化した。
モデル膜貫通ヘリックス(AALALAA)_3間の相互作用を蛍光励起エネルギー移動(FRET)により検出可能な事を示して来たが、FRETペアとしてCy3-Cy5ペアの代わりにより強い蛍光強度が期待できるCy3B-Cy5ペアを用いて実験を行った。Cy3をCy3Bに代えることで約1.6倍のシグナル/ノイズ比の改善が見られた。また蛍光のブリンキング、ブリーチングを抑えるには、還元剤Troloxと酸化剤Methyl viologenを併用すると良い事が明らかになった。強い自己会合が予想されるPOPC/コレステロール=7/3の組成のLUV中に、Cy3B/Cy5ラベルヘリックスを組み込み、Cy3B/Cy5の蛍光強度変化を同時測定した。ブリーチングによりCy5、Cy3Bがそれぞれ1つづつ組み込まれていたLUVを同定した。蛍光強度変化の解析を行った所、Cy3BからCy5へのFRETに揺らぎが観測された。FRET効率をヒストグラム化した所、モノマーとダイマーに相当する2つの分布ピークが見られた。さらに、モノマーとダイマーの持続時間はexponential型の分布を示し、寿命がそれぞれ160msec,50msecであった。これらから計算できる会合定数は、定常光FRET測定から得られた会合力と良く対応した。以上よりリポソーム系での一分子FRET測定は膜でのタンパク質間相互作用揺らぎを計測するのに有用な方法であることが明らかになった。また、会合揺らぎはコレステロール存在下でのみ観測された事から、脂質組成は膜貫通ヘリックスの動的挙動に大きく影響することが明らかになった。

Research Products

• [Journal Article] Design of a soluble transmembrane helix for measurements of water-membrane partitioning (2010)
  • Author(s): Yoshiaki Yano, Norie Shimai, Katsumi Matsuzaki
  • Journal Title: J.Phys.Chem.B. 114 Pages: 1925-1931
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Tag-probe fluorescent labeling methods for live-cell imaging of membrane proteins (2009)
  • Author(s): Yoshiaki Yano, Katsumi Matsuzaki
  • Journal Title: Biochim.Biophys.Acta 1788 Pages: 2124-2131
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Association-dissociation kinetics for dimerization of transmembrane helices as detected by single molecule fluorescence spectroscopy (2010)
  • Author(s): 矢野義明、木谷亮太、松崎勝巳
  • Organizer: 5^<th> International Peptide Symposium
  • Place of Presentation: Kyoto Conference Center(京都府)
  • Year and Date: 2010-12-06
• [Presentation] Fluctuation of interaction between transmembrane helices as detected by single-molecule fluorescence microscopy (2010)
  • Author(s): 矢野義明、木谷亮太、松崎勝巳
  • Organizer: 第48回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 東北大学川内キャンパス(宮城県)
  • Year and Date: 2010-09-21
• [Presentation] 新規蛍光ラベル法を用いた生細胞膜での受容体オリゴマー解析法の開発 (2010)
  • Author(s): 矢野義明
  • Organizer: 第8回次世代を担う若手のためのフィジカル・ファーマフォーラム
  • Place of Presentation: 岡山(岡山大学)
  • Year and Date: 2010-03-26
• [Presentation] OLIGOMERIZATION OF MEMBRANE RECEPTORS : FRET ANALYSIS USING COILED-COIL TAG-PROBE LABELING AND SPECTRAL IMAGING (2010)
  • Author(s): Yoshiaki Yano, Kaoru Omae, Katsumi Matsuzaki
  • Organizer: Biophysical Society 54th Annual Meeting
  • Place of Presentation: San Francisco (Moscone Centor)
  • Year and Date: 2010-02-21
• [Presentation] コイルドコイル蛍光ラベル法を用いた生細胞での受容体の可視化解析 (2009)
  • Author(s): 矢野義明
  • Organizer: 大阪大学蛋白質研究所セミナー「膜蛋白質の機能発現メカニズムの解明に向けて-細胞膜上での事象の解析-」
  • Place of Presentation: 大阪(蛋白質研究所)
  • Year and Date: 2009-09-24
• [Remarks]
  • URL: http://www.pharm.kyoto-u.ac.jp/yakkai/index.html
• [Remarks] 研究ホームポージ
  • URL: http://www.pharm.kyoto-u.ac.jp/yakkai/