ループ変異による協調的内部運動摂動を利用した蛋白質活性部位の揺らぎの制御

• Project Area: Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions
• Project/Area Number: 21107521
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 楯 真一 広島大学, 理学研究科, 教授 (20216998)
• Project Period (FY): 2009 – 2010
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2010)
• Budget Amount: ¥7,150,000 (Direct Cost: ¥5,500,000、Indirect Cost: ¥1,650,000); Fiscal Year 2010: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000); Fiscal Year 2009: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
• Keywords: 生物物理 / 生体分子 / 蛋白質

Research Abstract

ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)の野生体・G67V変異体の2種類に絞り,緩和分散測定を3点の温度で実施することで,ループ変異により誘導される「揺らぎの変化」の熱力学量を明らかにすることができた.また,stopped-flowを用いてhydride transfer過程における速度変化・熱力学量変化を計算し,遠隔位のループに対する変異が反応のtransition stateに対して大きな変化を与えることを明らかにした.
1.G67V変異による構造揺らぎの変化:緩和分散解析の結果から,G67V変化により揺らぎの結果生じる低存在率構造の安定性が0.1kcal/molとわずかに低下することが分かった.揺らぎにより誘導される構造の変化は大きくはないが,構造揺らぎの速度は変異導入により約3倍速くなり,構造揺らぎの過程で生じる過渡的構造に大きな変化が生じることが明らかになった.構造変化の過程で生じる過渡構造のエンタルピーはG67Vは野生型の2倍近い大きさとなり,さらにエントロピー項の寄与は7倍にまで増大する.この結果,構造変化の活性化自由エネルギーは,変異体は野生型よりも1 kcal/molだけ低下することがわかった.
2.Hydride transfer過程における影響:stopped flowを用いてhydride transfer速度を複数温度点で測定しEyring plotを用いてこの過程に伴う熱力学量を算出した.その結果,変異導入により活性化自由エネルギーは0.2kcal/molだけ低下することが分かった.変異導入により反応過程におけるエンタルピーの寄与は野生体に対して不利になる一方で,エントロピー的には有利な過程になるという反応過程変調の特徴を明らかにした.

Research Products

• [Journal Article] The NMR structure of FliK, the trigger for the switch of substrate specificity in the flagellar type III secretion apparatus (2011)
  • Author(s): Mizuno, S., Amida, H., Kobayash, N., Aizawa, S., Tate, S.
  • Journal Title: J.Mol.Biol. Volume: (In press)
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Surface plasmon resonance study on functional significance of clustered organization of lectin-like oxidized LDL (LOX-1) (2011)
  • Author(s): Ohki, I., Amida, H., Yamada, R., Sugihara, M., Ishigaki, T., Tate, S.
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta Volume: 1814 Pages: 345-354
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Comparative study on dihydrofolate reductases from Shewanella species living in deep-sea and ambient atmospheric-pressure environments (2011)
  • Author(s): Murakami, C., Ohame, E., Tate, S., Gekko, K., Nakasone, K., Kato, C.
  • Journal Title: Extremophiles Volume: 15 Pages: 165-175
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] NMRで観測する超高分子量タンパク質の分子形態 (2011)
  • Author(s): 楯真一
  • Journal Title: 生物物理 Volume: 51 Pages: 84-87
  • NAID: 10028105827
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Coupling effects of distal loops on structural stability and enzymatic activity of Escherichia coli dihydrofolate reductase revealed by deletion mutants (2010)
  • Author(s): Horiuchi, Y., Ohmae, E., Tate, S., Gekko, K.
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta Volume: 1804 Pages: 846-855
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cloning and characterization of dihydrofolate reductases from deep-sea bacteria (2010)
  • Author(s): Murakami, C., Ohame, E., Tate, S., Gekko, K., Nakasone, K., Kato, C.
  • Journal Title: J.Biochem.(Tokyo) Volume: 147 Pages: 591-599
  • NAID: 10027875351
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Prorine cis/trans isomerase Pinl regulates peroxisome proliferator-activated receptor g activity through the direct binding to the AF-1 domain. (2010)
  • Author(s): Fujimoto, Y., Shiraki, T., Horiuchi, Y, Waku, T., Shigenaga, A., Otaka, A., Ikura, T., Igarashi, K., Aimoto, S., Tate, S., ^*Morikawa, K.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. 285 Pages: 3126-3132
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Coupling effects of distal loops on structural stability and enzymatic activity of Escherichia coli dihydrofolate reductase revealed by deletion mutants (2010)
  • Author(s): Horiuchi, Y, Ohmae, E., ^*Tate, S., ^*Gekko, K
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta 1804 Pages: 846-855
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Comprehensive secondary-structure analysis of disulfide variants of lysozyme by synchrotron-radiation vacuum-ultraviolet circular dichroism. (2009)
  • Author(s): Matsuo, K., Watanabe, H., Tate, S., Tachibana, H., ^*Gekko, K
  • Journal Title: Protein 77 Pages: 191-201
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Phosphorylated intrinsically disordered region of fact masks its nucleosomal DNA binding elements (2009)
  • Author(s): Tsunaka, Y., Toga, J., Yamaguchi, H., Tate, S., Hirose, S., ^*Morikawa, K.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. 284 Pages: 24610-24621
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cloning and Characterization of Dihydrofolate Reductases from Deep-Sea Bacteria (2009)
  • Author(s): Murakami, C., ^*Ohmae, E., Tate, S., Gekko, K., Nakasako, K., Kato, C.
  • Journal Title: J.Biochem.(Tokyo) 147 Pages: 591-599
  • NAID: 10027875351
  • Peer Reviewed
• [Presentation] タンパク質構造情報利用技術としてのNMR-結晶構造解析に対する補完的利用 (2011)
  • Author(s): 楯真一
  • Organizer: よこはまNMR構造生物学研究会 第41回ワークショップ
  • Place of Presentation: 理研,横浜(招待講演)
  • Year and Date: 2011-03-02
• [Presentation] Alteration to internally correlated motion in protein by the mutation to a loop region (2010)
  • Author(s): Shin-ichi Tate
  • Organizer: PacifiChem.2010
  • Place of Presentation: Honolulu, USA(招待講演)
  • Year and Date: 2010-12-18
• [Presentation] Preferential domain orientation in HMGB2 protein revealed by NMR spectroscopy (2010)
  • Author(s): Jun-ichi Uewaki, Naoko Tate, Shin-ichi Tate
  • Organizer: PacifiChem.2010
  • Place of Presentation: Honolulu, USA
  • Year and Date: 2010-12-18
• [Presentation] クロマチンリモデリング因子FACTのリン酸化による機能制御機構 (2010)
  • Author(s): 松井理恵子, 橋本愛美, 上脇隼一, 津中康央, 森川耿右, 楯真一
  • Organizer: 第33回日本分子生物学会年会・第83日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2010-12-09
• [Presentation] Exploring the ligand-binding mechanism of LOX-1 by surface plasmon resonance (2010)
  • Author(s): 山田梨紗都, 編田宏一, 大木出, 楯真一
  • Organizer: 第33回日本分子生物学会年会・第83日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2010-12-08
• [Presentation] NMR analysis on the changes of structural dynamics and functions induced by loop mutations in DHFR (2010)
  • Author(s): 和田侑士, 堀内祐司, 大前英司, 楯真一
  • Organizer: 第33回日本分子生物学会年会・第83日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2010-12-08
• [Presentation] HMGB2タンパク質に含まれる2つのドメイン相対配向とリンカーの役割 (2010)
  • Author(s): 上脇隼一, 楯直子, 楯真一
  • Organizer: 第49回 NMR討論会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2010-11-17
• [Presentation] べん毛フック長さ制御タンパク質FliKのNMR構造解析 (2010)
  • Author(s): 水野志乃, 編田宏一, 小林直宏, 藤原敏道, 相沢慎一, 楯真一
  • Organizer: 第49回 NMR討論会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2010-11-17
• [Presentation] Protein structure determination using orientation induced TROSY shift changes (2010)
  • Author(s): Shin-ichi Tate
  • Organizer: 第49回 NMR討論会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2010-11-16
• [Presentation] 異方性スピン相互作用を用いた新規NMR法によるPin1の基質依存的な構造変化解析 (2010)
  • Author(s): 廣口典輝, 堀内佑司, 白木拓磨, 楯真一
  • Organizer: 日本化学会西日本大会
  • Place of Presentation: 熊本大学,熊本
  • Year and Date: 2010-11-06
• [Presentation] HMGB2タンパク質に含まれる2つのドメイン相対配向とリンカーの役割 (2010)
  • Author(s): 上脇隼一, 楯直子, 楯真一
  • Organizer: 日本生物物理学会 第48回年会
  • Place of Presentation: 東北大学,仙台
  • Year and Date: 2010-09-20
• [Presentation] べん毛フックの長さ制御因子FliKのNMRによる構造解析 (2010)
  • Author(s): 水野志乃, 楯真一, 相沢慎一
  • Organizer: 日本生物物理学会 第48回年会
  • Place of Presentation: 東北大学,仙台
  • Year and Date: 2010-09-20
• [Presentation] 異方性スピン相互作用を用いた新規NMR法によるPin1の基質依存的な構造変化解析 (2010)
  • Author(s): 廣口典輝, 堀内佑司, 白木拓磨, 楯真一
  • Organizer: 日本生物物理学会 第48回年会
  • Place of Presentation: 東北大学,仙台
  • Year and Date: 2010-09-20
• [Presentation] クロマチンリモデリングタンパク質のリン酸化による構造機能制御機構の解明 (2010)
  • Author(s): 橋本愛美, 松井理恵子, 上脇隼一, 津中康央, 森川耿右, 楯真一
  • Organizer: 日本生物物理学会 第48回年会
  • Place of Presentation: 東北大学,仙台
  • Year and Date: 2010-09-20
• [Presentation] クロマチンリモデリングタンパク質のリン酸化による構造機能制御機構の解明 (2010)
  • Author(s): 橋本愛美, 松井理恵子, 上脇隼一, 楯真一
  • Organizer: 日本生物高分子学会 年会
  • Place of Presentation: 兵庫県立大学,兵庫
  • Year and Date: 2010-09-18
• [Presentation] 高磁場NMRを用いる蛋白質の動的構造解析の可能性 (2010)
  • Author(s): 楯真一
  • Organizer: 大阪大学蛋白質研究所セミナー超高磁場が拓く生体系NMR
  • Place of Presentation: 阪大,大阪(招待講演)
  • Year and Date: 2010-07-30
• [Presentation] Alignment induced TROSY shift changes applied to protein structure determination (2010)
  • Author(s): Shin-ichi Tate
  • Organizer: WWMR2010
  • Place of Presentation: Florence, Italy
  • Year and Date: 2010-07-05
• [Presentation] 溶液中での高分子量タンパク質分子形態変化観測のためのNMR技術 (2010)
  • Author(s): 楯真一
  • Organizer: 第10回蛋白質化学会年会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター,札幌(招待講演)
  • Year and Date: 2010-06-17
• [Presentation] NMRによるヌクレオソームシャペロンタンパク質HMGB2のリンカーに制御されるドメイン相対配向 (2010)
  • Author(s): 上脇隼一, 森内寛, 楯直子, 楯真一
  • Organizer: 第51回 日本生化学会 中国・四国支部例会
  • Place of Presentation: 山口大学,山口
  • Year and Date: 2010-05-14
• [Presentation] クロマチンリモデリングタンパク質のリン酸化による構造機能制御機構の解明 (2010)
  • Author(s): 橋本愛美, 松井理恵子, 上脇隼一, 楯真一
  • Organizer: 第2回 日本生物物理学会 中国四国支部例会
  • Place of Presentation: 愛媛大学,愛媛
  • Year and Date: 2010-05-09
• [Presentation] NMRによる蛋白質の構造揺らぎと機能制御相関の観測 (2010)
  • Author(s): 楯真一
  • Organizer: 新学術領域研究シンポジウム「蛋白質の基質結合や構造変化における分子揺らぎの意義を討論する会」
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2010-03-04
• [Presentation] Ligand-induced protein structural changed revealed by orientation induced TROSY shift changes (2009)
  • Author(s): Shin-ichi Tate
  • Organizer: 第48回NMR討論会
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 2009-11-11
• [Presentation] NMRによるヌクレオソームシャペロンタンパク質HMGB2のドメイン相対配向解析 (2009)
  • Author(s): 上脇準一, 森内寛, 楯直子, 楯真一
  • Organizer: 第48回NMR討論会
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 2009-11-10
• [Presentation] DIORITE法を用いた高分子量タンパク質のドメイン相対配向解析 (2009)
  • Author(s): 岸本浩一, 田中利好, 河野俊之, 楯真一
  • Organizer: 第48回NMR討論会
  • Place of Presentation: 福岡
  • Year and Date: 2009-11-10
• [Presentation] NMRによるヌクレオソームシャペロンタンパク質HMGB2のドメイン相対配向解析 (2009)
  • Author(s): 上脇準一, 森内寛, 楯直子, 楯真一
  • Organizer: 2009年度日本化学会西日本大会
  • Place of Presentation: 愛媛
  • Year and Date: 2009-11-08
• [Presentation] Protein structural dynamics and function relationships revealed by NMR spectroscopy (2009)
  • Author(s): Shin-ichi Tate
  • Organizer: 第47回日本生物物理学会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2009-10-31
• [Presentation] HMGB2タンパク質に含まれる2つのドメインの溶液中における相対配向の決定 (2009)
  • Author(s): 上脇準一, 森内寛, 楯直子, 楯真一
  • Organizer: 第82回日本生化学会大会シンポジウム
  • Place of Presentation: 徳島
  • Year and Date: 2009-10-29
• [Presentation] 酸化LDL受容体蛋白質LOX-1の構造機能特性と本来の役割 (2009)
  • Author(s): 楯真一
  • Organizer: 第82回日本生化学会大会シンポジウム
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2009-10-21
• [Presentation] NMRを用いたKcsAイオンチャネル開閉に伴う分子形態変化観測-試料調製の最適化とNMRスペクトル解析 (2009)
  • Author(s): 網田宏一, 楯真一
  • Organizer: 特定領域シンポジウム「イオンチャネルの構造ダイナミクスII」
  • Place of Presentation: 福井
  • Year and Date: 2009-08-31
• [Presentation] NMRによる高分子量タンパク質分子形態変化観測技術-新たなタンパク質立体構造情報利用技術の開発に向けて (2009)
  • Author(s): 楯真一
  • Organizer: 大阪大学蛋白質研究所セミナー「実験と計算機科学で解明する蛋白質機能構造」
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 2009-07-31
• [Book] 広がるNMRの世界(朝倉哲朗 編)(章著:タンパク質の分子形態変化の観測) (2011)
  • Author(s): 楯真一
  • Total Pages: 182
  • Publisher: コロナ社