高圧力NMR法による蛋白質の準安定状態にもとづいた構造・機能相関

• Project Area: Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions
• Project/Area Number: 21107525
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Ritsumeikan University
• Principal Investigator: 北原 亮 立命館大学, 薬学部, 講師 (70512284)
• Project Period (FY): 2009 – 2010
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2010)
• Budget Amount: ¥7,020,000 (Direct Cost: ¥5,400,000、Indirect Cost: ¥1,620,000); Fiscal Year 2010: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000); Fiscal Year 2009: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000)
• Keywords: NMR / 高圧力 / 蛋白質 / 高エネルギー構造 / 水和 / 圧力 / 構造揺らぎ / ユビキチン / 人工設計

Research Abstract

代表者らの高圧力NMR研究によりユビキチンの準安定構造N2の構造解析が3000気圧下でなされている。N2構造は常圧下では10%程度の存在確率であり、その精密な構造解析や機能解明を目的としてN2構造を模倣するモデル変異体の合理的設計を行った。1気圧下のN1構造と3000気圧下のN2構造を比較して減弱している相互作用を特定した。またユビキチン様蛋白質の配列及び構造アラインメント解析を行い、保存性の高い部位や相互作用を特定した。それらに基づいてQ41Aなど4種類の変異体を作成した。1H/15N化学シフト解析から、変異に伴い一部で顕著な変化が見られた。変異によるシフト変化と圧力によるそれに明確な相関が得られたことから、変異により高圧下と同様にN2構造の分布率が増加したと考えられる。Q41AではN2分布率52%まで増加した。15N-スピン緩和測定(R1,R2,NOE)を行い主鎖の運動性を解析した。ピコ秒～ナノ秒の速い運動についてはWTと同レベルであった。横緩和測定(R2値)をWTのそれと比較すると、αヘリックス領域を中心に明確な増加が観測されたことから、N1-N2間の構造揺らぎがR2の化学交換項に寄与していることが示唆された。Cleanex-PM-NMR測定(水和アミドプロトンの特定)により、αヘリックス領域で明確な水和信号が観測されたことから、N2構造の分布率増加が裏付けられた。また野生型と変異体で相互作用ペプチドUIMやE1-E2-E3カスケード反応による機能性の評価を行った。

Research Products

• [Journal Article] Structural plasticity of staphylococcal nuclease probed by perturbation with pressure and pH (2011)
  • Author(s): Ryo Kitahara, Kazumi Hata, Akihiro Maeno, Kazuyuki Akasaka, Michael Chimenti, Bertrand Garcia-Moreno, E.Martin, A.Schroer, Christoph Jeworrek, Metin Tolan, Roland Winter, Julien Roche, Christian Roumest, Karine Montet de Guillen, Catherine A.Royer
  • Journal Title: Proteins Volume: 79 Pages: 1293-1305
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Solution structure of LC5, the CCR5-derived peptide for HIV-1 inhibition (2010)
  • Author(s): K.Miyamoto. Kayo Togiya, Ryo Kitahara et al.
  • Journal Title: J.Peptide Science 16 Pages: 165-170
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Pressure-dependent structure changes in Barnase on ligand binding reveal intermediate rate functions (2009)
  • Author(s): D.J.Wilton, Ryo Kitahara, et al.
  • Journal Title: Biophysical Journal 97 Pages: 1482-1490
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 高圧力NMRで見る蛋白質の高エネルギー構造の世界 (2011)
  • Author(s): 北原亮
  • Organizer: よこはまNMR構造生物学研究会第41回ワークショップ
  • Place of Presentation: 理化学研究所横浜研究所(神奈川県)
  • Year and Date: 2011-03-02
• [Presentation] The Functional Importance of Locally Disordered Structures of Proteins (2011)
  • Author(s): Ryo Kitahara
  • Organizer: Intrinsically disordered regions in proteins and related topics
  • Place of Presentation: 立命館大学(滋賀県)
  • Year and Date: 2011-01-31
• [Presentation] High pressure NMR reveals a locally disordered conformation of insulin (2010)
  • Author(s): Ryo Kitahara, Akiko Tanji, Souichirou Kitazawa, Yoshihiro Taniguchi
  • Organizer: Pacifichem2010
  • Place of Presentation: ハワイ・アメリカ
  • Year and Date: 2010-12-19
• [Presentation] High-Energy State Mutant of Ubiquitin (2010)
  • Author(s): Soichiro Kitazawa, Maho Yagi, Kenji Sugase, Koichi Kato, Ryo Kitahara
  • Organizer: The 4th International Symposium, Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions
  • Place of Presentation: 近江ピアザ(滋賀県)
  • Year and Date: 2010-11-30
• [Presentation] NMR Characterization of High-Energy state of ubiquitin and poly-ubiquitin (2010)
  • Author(s): Ryo Kitahara
  • Organizer: The 4th International Symposium, Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions
  • Place of Presentation: 近江ピアザ(滋賀県)
  • Year and Date: 2010-11-30
• [Presentation] 準安定状態が安定化されたユビキチン変異体 (2010)
  • Author(s): 北沢創一郎、矢木真穂、菅瀬謙治、加藤晃一、北原亮
  • Organizer: 第49回NMR討論会
  • Place of Presentation: タワーホール船堀(東京都)
  • Year and Date: 2010-11-15
• [Presentation] 高圧力NMR法によるLys48結合型ジユビキチンの構造揺らぎ (2010)
  • Author(s): 北原亮、平野貴志、矢木真穂、秦和澄、赤坂一之、加藤晃一
  • Organizer: 第49回NMR討論会
  • Place of Presentation: タワーホール船堀(東京都)
  • Year and Date: 2010-11-15
• [Presentation] 準安定構造が安定化したユビキチン変異体のNMR解析 (2010)
  • Author(s): 北沢創一郎, 矢木真穂, 菅瀬謙治, 加藤晃一, 北原亮
  • Organizer: 第60回日本薬学会近畿支部総会・大会
  • Place of Presentation: 摂南大学(大阪府)
  • Year and Date: 2010-10-30
• [Presentation] Conformational fluctuation of highly stable form of staphylococcal nuclease delta +pHS and its V66K variant studied by high pressure NMR spectroscopy (2010)
  • Author(s): Ryo Kitahara, Kazumi Hata, Akihiro Maeno Michael Chimenti, Bertrand Garcia-Moreno, E.Julien Roche, Christian Roumestand, Karine Montet de Guillen, Catherine A.Royer, Kazuyuki Akasaka
  • Organizer: 第48回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 東北大学(宮城県)
  • Year and Date: 2010-09-21
• [Presentation] Dynamics of Lys48-linked di-ubiquitin as studied by NMR spectroscopy (2010)
  • Author(s): Takashi Hirano, Olivier Serve, Maho Yagi, Tsunehiro Mizushima, Ryo Kitahara, Koichi Kato
  • Organizer: 第48回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 東北大学(宮城県)
  • Year and Date: 2010-09-21
• [Presentation] High pressure NMR reveals significant shifts in populations of higher-energy conformers in ubiquitin variants (2010)
  • Author(s): Souichirou Kitazawa, Maho Yagi, Koichi Kato, Kazuyuki Akasaka4, Ryo Kitahara
  • Organizer: 第48回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 東北大学(宮城県)
  • Year and Date: 2010-09-21
• [Presentation] The Functional Importance of Locally Disordered Structures of Proteins (2010)
  • Author(s): Ryo Kitahara, Kazuyuki Akasaka
  • Organizer: 第48回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 東北大学(宮城県)
  • Year and Date: 2010-09-21
• [Presentation] Conformational fluctuation of Lys48-linked diubiquitin characterized by high-pressure NMR spectroscopy (2010)
  • Author(s): Ryo Kitahara, Takashi Hirano, Maho Yagi, Kazumi Hata, Yoshihiro Taniguchi, Kazuyuki Akasaka, Koichi Kato
  • Organizer: 第48回日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 東北大学(宮城県)
  • Year and Date: 2010-09-20
• [Presentation] High pressure NMR reveals evolutinally conserved intermediates between ubiquitin and NEDD8 (2010)
  • Author(s): Ryo Kitahara
  • Organizer: 13th international symposium at MNRC
  • Place of Presentation: 滋賀医科大学(滋賀県)
  • Year and Date: 2010-09-01
• [Presentation] High-pressure NMR characterizes conformational fluctuation of Lys48-linked diubiquitin (2010)
  • Author(s): Ryo Kitahara, Takashi Hirano, Maho Yagi, Kazumi Hata, Yoshihiro Taniguchi, Kazuyuki Akasaka, Koichi Kato
  • Organizer: 24th International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
  • Place of Presentation: ケアンズ オーストラリア
  • Year and Date: 2010-08-23
• [Presentation] Conformational fluctuation of highly stable form of staphylococcal nuclease ・+PHS and its V66K variant studied by high pressure NMR spectroscopy (2010)
  • Author(s): Ryo Kitahara, Kazumi Hata, Akihiro Maeno Michael Chimenti, Bertrand Garcia-Moreno, E.Julien Roche, Christian Roumestand, Karine Montet de Guillen, Catherine A.Royer, Kazuyuki Akasaka
  • Organizer: 24th International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems
  • Place of Presentation: ケアンズ オーストラリア
  • Year and Date: 2010-08-23
• [Presentation] 高圧力NMR法によるユビキチンの高エネルギー構造に基づく構造-機能相関研究 (2010)
  • Author(s): 北原亮、北沢創一郎、坂田絵理、平野貴志、矢木内海真穂、谷口吉弘、水島恒裕、赤坂一之、加藤晃一
  • Organizer: 第10回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター(北海道)
  • Year and Date: 2010-06-18
• [Presentation] Comparative studies of conformational fluctuation of ubiquitin-like proteins by high pressure NMR (2009)
  • Author(s): Ryo Kitahara, Koichi Kato, Kazuyuki Akasaka
  • Organizer: The 3rd International Symposium, Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions
  • Place of Presentation: 名古屋市 名古屋大学豊田講堂
  • Year and Date: 2009-12-20
• [Presentation] Dynamics of di-ubiquitin as studied by NMR spectroscopy (2009)
  • Author(s): Takashi, Hirano, Maho Yagi, Tsunehiro Mizushima, Ryo Kitahara, Koichi Kato
  • Organizer: The 3rd International Symposium, Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions
  • Place of Presentation: 名古屋市 名古屋大学豊田講堂
  • Year and Date: 2009-12-20
• [Presentation] Intermediate conformer of the Lyme disease vaccine candidate OspA probed with variable pressure NMR spectroscopy (2009)
  • Author(s): Ryo Kitahara, Alana Simorellis Shigeyuki Yokoyama, Shohei Koide, Kazuyuki Akasaka
  • Organizer: NMR討論会
  • Place of Presentation: 博多市 九州大学馬出キャンパス医学部百年講堂
  • Year and Date: 2009-11-11
• [Presentation] Conformational fluctuation of di-ubiquitin studied by variable pressure NMR (2009)
  • Author(s): Ryo Kitahara, Takashi Hirano, Maho Yagi, Tsunehiro Mizushima, Kazumi Hata, Kazuyuki Akasaka, Koichi Kato
  • Organizer: 日本生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 徳島市 アスティ徳島
  • Year and Date: 2009-10-31
• [Presentation] Comparative studies of ubiquitin-like proteins by high pressure NMR reveal the crusial role of high-energy conformers in physiology (2009)
  • Author(s): Ryo Kitahara, Koichi Kato, Kazuyuki Akasaka
  • Organizer: 日本生化学会年会
  • Place of Presentation: 神戸市 神戸ポートアイランド
  • Year and Date: 2009-10-21
• [Book] 広がるNMRの世界-40人の研究者からの熱いメッセージ- (2011)
  • Author(s): 朝倉哲郎編著, 北原亮, ら
  • Total Pages: 182
  • Publisher: コロナ社
• [Remarks]
  • URL: http://www.ritsumei.ac.jp/pharmacy/kitahara/kitahara_lab.html