中性子解析によるATP結合タンパク質の水和構造とそのダイナミクス研究

• Project Area: Water plays a key role in ATP hydrolysis and ATP-driven functions of proteins
• Project/Area Number: 21118502
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Ibaraki University
• Principal Investigator: 新村 信雄 茨城大学, フロンティア応用原子科学研究センター, 特任教授 (50004453)
• Project Period (FY): 2009 – 2010
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2010)
• Budget Amount: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2010: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000); Fiscal Year 2009: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
• Keywords: ATPエネルギー交換 / 水和構造 / 負エントロピー / 中性子構造生物 / ATP結合タンパク質 / DAPK / SufC / 大型結晶育成 / death-associated protein kinase / トロンビ / 中性子回折 / 結合エネルギー / 阻害定数 / 複合体

Research Abstract

頭書テーマのモデルタンパク質としてDeath-associated protein kinase(DAPK)を選定
1.(DAPK)の発現
(1)宿主である大腸菌の使用コドンに従い最適化したDAPKリン酸化領域をコードするDNAをプラスミドベクターpET-20b(+)のNdel-Xholサイトにサブクローニングし、BL21(DE3)大腸菌株に形質転換し、大量培養する事によってDAPKを得た。
(2)DAPKの精製はNi Sepharose FF担体を用いた金属アフィニティ精製とHiPrep Sephacryl S-100 HRを用いたゲルろ過クロマトグラフィーで行った。
2.DAPKのATP結合状態、および非結合状態(Apo状態)の結晶育成
(1)PEG1000、硫酸アンモニウム、硫酸リチウムの三条件を重点的に最適化し単結晶を得る事が出来た。
(2)ATPアナログ物質としてアデニリル-イミド二リン酸(AMP-PNP)、アデノシン二リン酸(ADP)、アデノシンγチオ三リン酸(ATP-γS)を使用した。
3.DAPKのATP結合状態、および非結合状態(Apo状態)での水和水構造の違い。
(1)DAPKのX線結晶構造解析:DAPKに結合しているATPアナログ物質は10個以上の水分子と水和構造を形成している。これらの水分子は良くオーダーされており、はっきりと観測する事が出来たと言えるだろう。しかしAMP-PNP及びATP-γSのγ-リン酸基はディスオーダーしており、確実な原子位置を特定出来ているとは言い難い。
(2)DAPKの中性子結晶構造解析:中性子回折法での見かけの水和水構造はその運動状態を反映して、ブーメラン状、棒状、ボール状にそれぞれ見える。ATP結合状態とApo状態での水和水配向の自由度(エントロピー)の差に寄与るると考えられる。ATP結合状態、および非結合状態(Apo状態)、非ATP結合タンパク質の水分子の構造を求め、3状態での構造の違いを比較し、ATPと水分子との相互作用を解明する。引き続き中性子結晶構造解析のための大型結晶育成実施中。

Research Products

• [Journal Article] Neutron Structure Analysis by IBARAKI Biological Crystal Diffractometer (iBIX) in J-PARC (2011)
  • Author(s): Ichiro Tanaka
  • Journal Title: Acta Cryst Volume: D67 Pages: 892-899
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] X-ray and neutron protein crystallographic analysis of the trypsin-BPTI complex (2011)
  • Author(s): Kenji Kawamura
  • Journal Title: Acta Cryst Volume: D67 Pages: 140-148
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 茨城県生命物質構造解析装置(iBIX)による水素・水和構造研究/産業利用 (2011)
  • Author(s): 田中伊知朗
  • Journal Title: RADIOISOTOPES Volume: 60 Pages: 89-97
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A preliminary neutron crystallography on the trypsin-bovine pancreatic trypsin inhibitor complex (2010)
  • Author(s): K Kawamura
  • Journal Title: J.phys Volume: Conf.Ser.251
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A preliminary neutron diffraction analysis of Achromobacter protease I (2010)
  • Author(s): Yuki Ohnishi
  • Journal Title: J.phys. Volume: Conf.Ser.251
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Current Status of IBARAKI Biological Crystal Diffractometer iBIX-Several Examples of the Measurement (2010)
  • Author(s): Katsuhiro Kusaka
  • Journal Title: J.phys. Volume: Conf.Ser.251
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystallization phase diagram, the growth of large single crystals of bovine ββ-Lactoglobulin A (2010)
  • Author(s): D.Yagi
  • Journal Title: J.phys. Volume: Conf.Ser.251
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A neutron crystallographic analysis of a 'phosphate-free' ribonuclease A at 1.7A resolution (2009)
  • Author(s): Daichi Yagi
  • Journal Title: Acta Cryst D Pages: 892-899
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A neutron crystalographic analysis of T6 porcine insulin at a 2.1A resolution (2009)
  • Author(s): Wakari Iwai
  • Journal Title: Acta Cryst.D Pages: 1042-1050
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Development of data processing software for a new TOF single crystal neutron diffractometer at J-PARC (2009)
  • Author(s): Takashi Ohhara
  • Journal Title: Nucl.Instr.Methods Phys.Res A 600 Pages: 195-197
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Overview of a new biological neutron diffractometer(iBIX) in J-PARC (2009)
  • Author(s): Ichiro Tanaka
  • Journal Title: Nucl.Instr.Methods Phys.Res A 600 Pages: 161-163
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 特集 IUCr 2008:学術プログラム キーノート講演 中性子構造生物学-フォールディング構造を超えて- (2009)
  • Author(s): 新村信雄
  • Journal Title: 日本結晶学会誌 51 Pages: 29-35
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] カルチャーショック:タンパク質結晶にまつわる話 (2009)
  • Author(s): 新村信雄
  • Journal Title: 波紋 19 Pages: 49-53
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 稼働始めたJ-PARC中性子源 (2009)
  • Author(s): 新村信雄
  • Journal Title: 生物物理学会誌 49 Pages: 262-263
  • NAID: 10025975953
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ヒトートロンビン阻害剤複合体における水和構造 (2010)
  • Author(s): 山田太郎
  • Organizer: 日本中性子科学会第10回年会
  • Place of Presentation: 東北大学
  • Year and Date: 2010-12-11
• [Presentation] ヒトートロンビンの中性子解析 (2010)
  • Author(s): 山田太郎
  • Organizer: 平成22年度生命物質構造解析研究会 合同研究会
  • Place of Presentation: 東京国際フォーラム
  • Year and Date: 2010-10-01
• [Presentation] Preliminary neutron crystallographic study and X-ray structural analysis of mutant Transthyretin (2010)
  • Author(s): Takeshi Yokoyama
  • Organizer: 日本生物物理学会
  • Place of Presentation: 東北大学川内北キャンパス
• [Book] Neutron Protein Crystallography. -----Hydrogen, Proton & Hydration in Bio-macromolecules---- (2011)
  • Author(s): N.Niimura
  • Total Pages: 233
  • Publisher: Oxford University Press