トランスポーターにおけるATP駆動力共役メカニズムの立体構造基盤

• Project Area: Water plays a key role in ATP hydrolysis and ATP-driven functions of proteins
• Project/Area Number: 21118509
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 加藤 博章 京都大学, 薬学研究科, 教授 (90204487)
• Project Period (FY): 2009 – 2010
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2010)
• Budget Amount: ¥11,700,000 (Direct Cost: ¥9,000,000、Indirect Cost: ¥2,700,000); Fiscal Year 2010: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000); Fiscal Year 2009: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000)
• Keywords: 生理学 / 膜蛋白質 / X線解析 / 結晶構造 / 薬物輸送

Research Abstract

ABCトランスポーターは、ATP加水分解エネルギーを用いて基質の能動輸送を行っている。そのエネルギー共役メカニズムを解明するために、ATP加水分解を行うヌクレオチド結合ドメイン(NBD)と基質排出活性部位である膜貫通ドメイン(TMD)が相互作用する部位、すなわち2つの細胞内ヘリックス、IH1とIH2の役割をタンパク質工学的な手法を用いて調べた。
1)標的とした大腸菌MsbAの低解像度(5.5～4.5Å分解能)立体構造に基づいてIH1とIH2の領域を同定したところ、IN1は、Val113からGln119まで(VSFFDKQ)、IH2は、His214からLeu218まで(HKEVL)であると考えられた。そこで、IH1、IH2それぞれのアミノ酸残基をすべてAla残基へと置換した変異型MsbAを作成した。得られた変異型MsbA遺伝子は、野生型と同様に大腸菌にて発現させて精製した。その結果、IH1変異型は、野生型の70%、IH2変異型は、40%に活性が低下した。一方、ATP加水分解を活性させる基質を加えた場合、IH2変異型では、阻害を受けるようになった。このことは、IH1とIH2がエネルギー共役に関わること、特にIH2の役割が重要であることを示している。
2)MsbAよりも高解像度の結晶構造を得るため、好熱性紅藻由来のABCトランスポーターについて、酵母を用いた発現系を構築して大量精製を行い、3.5Å分解能での結晶を調製することに成功した。そして、水銀誘導体を用いて位相を決定し、X線結晶構造解析を達成した。その結果、IH1,IH2上のアミノ酸側鎖が相互作用する相手の詳細な立体構造情報が明らかとなった。

Research Products

• [Journal Article] Deleting two C-terminal alpha-helices is effective to crystallize the bacterial ABC transporter Eschrichia coli MsbA complexed with AMP-PNP (2010)
  • Author(s): Kanako Terakado
  • Journal Title: Acta Crystallographica Section D D66 Pages: 319-323
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Functional role of the linker region in purified human P-glycoprotein (2009)
  • Author(s): Tomomi Sato
  • Journal Title: FEBS Journal 276 Pages: 3504-3516
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 好熱性真核生物由来の多剤排出ABCトランスポーターの機能解析 (2011)
  • Author(s): 山口知宏
  • Organizer: 日本薬学会第131年会
  • Place of Presentation: ツインメッセ静岡(静岡市)
  • Year and Date: 2011-03-30
• [Presentation] 好熱性紅藻由来ABCトランスポーターの多剤排出活性の特徴 (2010)
  • Author(s): 山口知宏
  • Organizer: 第32回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
  • Place of Presentation: 富山国際会議場(富山市)
  • Year and Date: 2010-11-29
• [Presentation] 構造解析品質の膜蛋白質調製のための大量培養系 (2010)
  • Author(s): 加藤博章
  • Organizer: 第10回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター(札幌市)(招待講演)
  • Year and Date: 2010-06-18
• [Presentation] Functional role of the linker region in the mechanism of human P-glycoprotein (2010)
  • Author(s): 佐藤友美
  • Organizer: 3rd FEBS Special Meeting : ATP-Binding Cassette (ABC) Proteins : From Multidrug Resistance to Genetic Diseases
  • Place of Presentation: Hotel Grauer Bar, Innsbruck, Austria
  • Year and Date: 2010-03-01
• [Presentation] Deletion of C-terminal two alpha-helices is effective to crystallize the bacterial ABC transporter E.coli MsbA from AMP-PNP (2010)
  • Author(s): 寺角香菜子
  • Organizer: 3rd FEBS Special Meeting : ATP-Binding Cassette (ABC) Proteins : From Multidrug Resistance to Genetic Diseases
  • Place of Presentation: Hotel Grauer Bar, Innsbruck, Austria
  • Year and Date: 2010-02-28
• [Presentation] Isolation and biochemical characterization of an ABC transporter from a thermophilic red alga, Cyanidioschyzon merolae (2009)
  • Author(s): 山口知宏
  • Organizer: 第31回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
  • Place of Presentation: 大阪大学コンベンションセンター、大阪
  • Year and Date: 2009-12-01
• [Presentation] Functional role of the two intracellular helices. IH1 and IH2. in Escherichia coli ABC transporter MsbA (2009)
  • Author(s): 地主遼平
  • Organizer: 第31回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
  • Place of Presentation: 大阪大学コンベンションセンター、大阪
  • Year and Date: 2009-12-01