Publicly Offered Research
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
核内微小構造の多くは１００nm程度であるが、核小体をはじめとした膜が無い小器官であり、どのような機構で分子集合するかは不明である。我々がこれまで開発してきた新規の多点FCSによりオートファジー前駆体のPASが相分離により形成される液滴であることが証明された。近年核内微小構造も相分離により形成されることが示唆されてきたが、サイズが小さく通常のFCSによる拡散計測は困難であった。本研究では、3次元STEDと上記FCS法を組み合わせることで数百ナノメートルオーダーの核内微小領域内の分子拡散の特徴を定量化することで、相分離によりクロマチン状態が制御されている可能性を検証する。
核小体をはじめとした核質内に存在する細胞膜が存在しない微小器官は古くから知られるが、その形成機構は計測の限界から不明な点が多い。特に近年、転写活性の場やヘテロクロマチンが相分離により形成される可能性が示唆されてきたが、そのサイズは光学限界より小さい場合も多く、分子同士の強い結合により架橋された構造物か、高分子同士の弱い結合により流動性が維持された相分離液滴か決定的な証拠を見出すことは困難であった。現在の多くの核内分子動態のライブイメージングは全反射顕微鏡によるヒストン１分子計測が行われ、時間分解能１００ミリ秒程度が主流となっている。このため、本来の３次元を２次元平面に投影した分子運動を観察し、その平均自乗変位（MSD）を計算することで拡散係数などの分子動態が推定されてきた。従って、より速く３次元空間を行き交う分子の運動は未知であった。本研究の基礎となるFCSではレーザーを１点に集光させ、点像分布関数（PSF）内の通過分子の蛍光信号から自己相関を計算し、理論式から３次元の拡散係数を推定する手法だが、平均的な運動しか捉えられず、２次元MSDのような拡散の性質（拘束されているか、アクティブかなど）は抽出できなかった。本課題ではSTED顕微鏡によりSTED光の強度を変えPSFを絞ることで、様々なサイズの計測領域を通過する分子の平均的な通過時間が推定できることが分かり、サイズと時間の関係から時間分解能１００μsの計測に基づく３次元MSDの計算に成功した。これをヒストンH2Bに適用することで、核内では５ミリ秒以下の領域においてDNAに拘束されたヒストンだけではなく、核内空間を自由に動き回る成分も含まれていることが明らかになった。
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
All 2022 2021
All Presentation (4 results) (of which Invited: 1 results)
