ナノボディーによる標的ユビキチンリガーゼ複合体の細胞内動態の理解と応用
Publicly Offered Research
| Project Area | New frontier for ubiquitin biology driven by chemo-technologies |
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| Project/Area Number |
21H00288
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Complex systems
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| Research Institution | Osaka University (2022)
Kyushu University (2021) |
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Principal Investigator |
池田 史代 大阪大学, 大学院生命機能研究科, 教授 (50837151)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2023-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥7,280,000 (Direct Cost: ¥5,600,000、Indirect Cost: ¥1,680,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
Fiscal Year 2021: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
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| Keywords | ナノボディ / LUBAC / 直鎖型ユビキチン鎖 / 生化学的手法 / タンパク質精製 / ナノボディー / 細胞内動態 / ナノトラップ法 |
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| Outline of Research at the Start |
タンパク質の翻訳後修飾の一つであるユビキチン化はあらゆる生物学的効果に重要である。複数のユビキチン分子は、8つの型で結合することにより鎖ができる。その中で、直鎖型ユビキチン鎖は、炎症、感染や免疫の制御に重要な役割を果たす。この直鎖型ユビキチン鎖は、ユビキチンリガーゼ複合体LUBAC により誘導されるが、LUBAC構成因子の細胞内動態、組織や細胞種特異的なシグナルネットワークの形成とその生物学的効果については不明な部分が多い。本研究では、申請者のチームが独自に取得した単量体、単一ドメインの小分子であるナノボディーを基盤とした分子ツールの開発とLUBAC の新規制御メカニズムの解明を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、炎症、細胞死、選択的オートファジーや免疫制御に重要な直鎖型ユビキチン鎖を誘導する、ユビキチンリガーゼ複合体LUBACに着眼した。LUBACを構成する分子の細胞内動態、組織や細胞腫特異的なシグナルネットワークの形成とその生物学的効果を解明するのに適した分子ツールの開発することによるLUBAC の新規制御メカニズムの解明を目指して、申請者のチームが取得した単量体、単一ドメインの小分子であるナノボディーを利用した。期間中に、各LUBAC 構成因子を抗原とするラマ由来ナノボディークローンの精製法、ナノボディークローンのユビキチン化に対する影響の解析法、および細胞内における発現誘導法、ナノボディークローンによる免疫沈降法の各手法について確立した。ナノボディーのクローンは、anti-HOIP, anti-SHARPIN, anti-HOIL-1の全てにおいて、e.coliから効率的にリコンビナントタンパク質を得ることができた。特にanti-HOIL-1ナノボディークローンについては、in vitro ユビキチン化再構築系の実験により、LUBAC依存性のユビキチン化誘導を促進、もしくは抑制するクローンを得た。さらに、各クローンが免疫ブロッティング、免疫沈降において機能するかについても解析を行った。これらの解析結果を基に3クローンを選択し、抗原タンパク質との結合能、エピトープの解析を行った。さらに、細胞内においてGFP-tagナノボディーを発現し、細胞死に対する影響も解析した。本研究成果を基盤として、今後もanti-HOIP, anti-SHARPINの残りのクローン解析、細胞内動態と新規結合分子の解析について解析を進めていく。これらの研究成果および関連する概念について、当該年度中に国内および国際学会、国際雑誌に総説（査読あり）として発表している。
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| Research Progress Status |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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Report
(2 results)
Research Products
(18 results)
