新規on-chipスクリーニング技術による分子機械の機能改変

• Project Area: Molecular Engine: Design of Autonomous Functions through Energy Conversion
• Project/Area Number: 21H00388
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 上野 博史 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 講師 (10546592)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2023-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000); Fiscal Year 2022: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000); Fiscal Year 2021: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000)
• Keywords: 分子機械 / 進化分子工学 / ATPase / 回転分子モーター / マイクロデバイス

Outline of Research at the Start

本研究ではマイクロチャンバーデバイスを用いたF1-ATPaseのon-chipスクリーニング技術の確立およびマイクロチャンバーデバイス内におけるF1-ATPaseの分子進化（高活性化）の実現を目指す。最終的に得られた進化した（速く回転する）F1-ATPaseを、1分子回転解析および構造解析により詳細に調べる。その結果とこれまでの1分子回転解析や構造解析の知見とを照らし合わせることで、回転分子機械F1-ATPaseの回転速度の違いが何に起因しているのかというF1モーターの作動原理の一端を明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではATPの化学エネルギーを力学的な回転運動へと変換する回転分子機械F1-ATPase を新規進化分子工学的手法により分子進化させ、機能改変した分子機械を創成することを目的とする。そこで本研究では、我々がこれまでに確立してきたマイクロチャンバーデバイス内でのon-chipスクリーニング技術の拡張を行った。デバイス内でのスクリーニングを実現するにはF1-ATPaseの反応のデバイス内検出が必須になる。そこでATP分解で生じるADPを酵素カップリング反応によりデバイス内で蛍光検出する新規方法を開発した。その結果、F1-ATPase１分子のATPase活性のデバイス内定量を実現した。デバイス内でのATPaseの1分子活性の定量に成功したのは本研究が初めてである。現在、この系を用いたスクリーニングを検討中である。また別のアプローチとして、F1-ATPaseの1分子回転観察と無細胞タンパク質合成系を組み合わせた新規on chipスクリーニグ技術を開発した。この系は、配列既知のDNAライブラリを用いてF1-ATPaseの無細胞合成を行った後、on-chipに転写し1分子回転観察を行うもので、細胞を全く使わずにDNAライブラリからのF1-ATPaseの合成・1分子回転計測を数時間で実現することができる。この実験系により、リン酸解離に関わるとMDシミュレーションで予測された残基の20種類の変異F1を1度の実験（数時間程度）で1分子回転解析することを実現し、各変異がF1の触媒反応過程や回転機能に与える影響を詳細に解析することに成功している。

Research Progress Status

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of New South Wales(オーストラリア)
• [Int'l Joint Research] Stockholm University(スウェーデン)
• [Int'l Joint Research] University of New South Wales(オーストラリア)
• [Int'l Joint Research] Stockholm University(スウェーデン)
• [Journal Article] Rotary properties of hybrid F1-ATPases consisting of subunits from different species (2023)
  • Author(s): Ryo R. Watanabe, Busra Tas Kiper, Mariel Zarco-Zavala, Mayu Hara, Ryohei Kobayashi, Hiroshi Ueno, Jose J. Garcia-Trejo, Chun-Biu Li, Hiroyuki Noji
  • Journal Title: iScience Volume: 26 Issue: 5 Pages: 106626-106626
  • DOI: 10.1016/j.isci.2023.106626
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Molecular mechanism on forcible ejection of ATPase inhibitory factor 1 from mitochondrial ATP synthase (2023)
  • Author(s): Kobayashi Ryohei、Ueno Hiroshi、Okazaki Kei-ichi、Noji Hiroyuki
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 14 Issue: 1 Pages: 1-12
  • DOI: 10.1038/s41467-023-37182-9
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Genetic Perturbation Alters Functional Substates in Alkaline Phosphatase (2023)
  • Author(s): Sakuma Morito、Honda Shingo、Ueno Hiroshi、Tabata Kazuhito V.、Miyazaki Kentaro、Tokuriki Nobuhiko、Noji Hiroyuki
  • Journal Title: Journal of the American Chemical Society Volume: 145 Issue: 5 Pages: 2806-2814
  • DOI: 10.1021/jacs.2c06693
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Direct identification of the rotary angle of ATP cleavage in F1-ATPase from Bacillus PS3 (2023)
  • Author(s): Hasimoto Yuh、Sugawa Mitsuhiro、Nishiguchi Yoshihiro、Aeba Fumihiro、Tagawa Ayari、Suga Kenta、Tanaka Nobukiyo、Ueno Hiroshi、Yamashita Hiroki、Yokota Ryuichi、Masaike Tomoko、Nishizaka Takayuki
  • Journal Title: Biophysical Journal Volume: 122 Issue: 3 Pages: 554-564
  • DOI: 10.1016/j.bpj.2022.12.027
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural Elements Involved in ATP Hydrolysis Inhibition and ATP Synthesis of Tuberculosis and Nontuberculous Mycobacterial F-ATP Synthase Decipher New Targets for Inhibitors (2022)
  • Author(s): Wong Chui Fann、Saw Wuan-Geok、Basak Sandip、Sano Mio、Ueno Hiroshi、Kerk Hwee Wen、Litty Dennis、Ragunathan Priya、Dick Thomas、M?ller Volker、Noji Hiroyuki、Gr?ber Gerhard
  • Journal Title: Antimicrobial Agents and Chemotherapy Volume: 66 Issue: 12
  • DOI: 10.1128/aac.01056-22
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Direct observation of stepping rotation of V-ATPase reveals rigid component in coupling between Vo and V1 motors (2022)
  • Author(s): Otomo Akihiro、Iida Tatsuya、Okuni Yasuko、Ueno Hiroshi、Murata Takeshi、Iino Ryota
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 119 Issue: 42
  • DOI: 10.1073/pnas.2210204119
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Enzyme-based digital bioassay technology ? key strategies and future perspectives (2022)
  • Author(s): Noji Hiroyuki、Minagawa Yoshihiro、Ueno Hiroshi
  • Journal Title: Lab on a Chip Volume: 22 Issue: 17 Pages: 3092-3109
  • DOI: 10.1039/d2lc00223j
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] How Does F1-ATPase Generate Torque?: Analysis From Cryo-Electron Microscopy and Rotational Catalysis of Thermophilic F1 (2022)
  • Author(s): Noji Hiroyuki、Ueno Hiroshi
  • Journal Title: Frontiers in Microbiology Volume: 13 Pages: 904084-904084
  • DOI: 10.3389/fmicb.2022.904084
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Amplification of Over 100 kbp DNA from Single Template Molecules in Femtoliter Droplets (2021)
  • Author(s): Ueno,H., Sawada,H., Soga,N., Sano,M., Nara,S., Tabata,K.V., Su’etsugu, M., Noji,H.
  • Journal Title: ACS Synthetic Biology Volume: 10 Issue: 9 Pages: 2179-2186
  • DOI: 10.1021/acssynbio.0c00584
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The six steps of the complete F1-ATPase rotary catalytic cycle (2021)
  • Author(s): Sobti Meghna、Ueno Hiroshi、Noji Hiroyuki、Stewart Alastair G.
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 12 Issue: 1 Pages: 4690-4690
  • DOI: 10.1038/s41467-021-25029-0
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Elucidation and control of low and high active populations of alkaline phosphatase molecules for quantitative digital bioassay (2021)
  • Author(s): Ueno Hiroshi、Kato Makoto、Minagawa Yoshihiro、Hirose Yushi、Noji Hiroyuki
  • Journal Title: Protein Science Volume: 30 Issue: 8 Pages: 1628-1639
  • DOI: 10.1002/pro.4102
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Engineering approaches to understanding the unidirectional regulatory function of F1-ATPase (2022)
  • Author(s): Hiroshi Ueno
  • Organizer: 2022 East Asian Single-Molecule Biophysics Symposium
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] エンジニアリング的アプローチによる回転分子モーターF1-ATPaseの設計原理の理解 (2022)
  • Author(s): 上野博史
  • Organizer: 第11回分子モーター討論会
  • Invited
• [Presentation] 全反射型暗視野顕微鏡による生体分子モーターの1分子イメージング (2022)
  • Author(s): 上野博史
  • Organizer: ニコンWebセミナー
  • Invited
• [Presentation] Engineering approaches to understanding the design principles of F1-ATPase (2022)
  • Author(s): Hiroshi Ueno
  • Organizer: Sendai2022 Workshop
  • Invited
• [Presentation] ) Unidirectional regulation of ATPase factor 1 in mitochondrial ATP synthase studied by single-molecule manipulation experiments (2022)
  • Author(s): Ryohei Kobayashi, Hiroshi Ueno, Kei-ichi Okazaki, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Torque Generation Mechanism of F1 -ATPase (2022)
  • Author(s): Hiroyuki Noji, Hiroshi Ueno
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Resurrection of the Ancestral ATPase (2022)
  • Author(s): Aya Suzuki, Ryutaro Furukawa, Hiroshi Ueno, Satoshi Akanuma, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Rotation dynamics and structure of F1-ATPase with all α-subunit-type P-loops (2022)
  • Author(s): Hiroshi Ueno, Meghna Sobti, Rie Koga, Tomoko Masaike, Alastair Stewart, Nobuyasu Koga, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Development of new DNA recovery technology from fL droplet array using optical tweezers (2022)
  • Author(s): Tetsuya Ohashi, Hiroshi Ueno, Yoshihiro Minagawa, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会年会
• [Presentation] In vitro screening of F1 -ATPase based on single molecule rotation assay coupled to cell-free protein synthesis (2022)
  • Author(s): Mai Taguchi, Hiroshi Ueno, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会年会
• [Presentation] ATP driven rotation of mutant FoF1 where H+ translocation is rate-limiting (2022)
  • Author(s): Kiyoto Yasuda, Daichi Ando, Ryohei Kobayashi, Hiroshi Ueno, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Fluorometric digital ATPase assay with single-enzyme detection sensitivity (2021)
  • Author(s): Hiroshi Ueno, Mio Sano, Mayu Hara, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第59回日本生物物理学会年会
• [Presentation] In vitro synthesis of F1 -ATPase and construction of single molecule rotation assay system for cell-free screening (2021)
  • Author(s): Mai Taguchi, Hiroshi Ueno, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第59回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Correlation between the fluctuation of single enzyme activity and evolvability (2021)
  • Author(s): Takahito Iida, Hiroshi Ueno, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第59回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Elucidation of molecular recognition mechanism of IF1 , a regulator of F1 -ATPase, studied by an engineering approach (2021)
  • Author(s): Yuichiro Hatasaki, Ryo Watanabe, Ryohei Kobayashi, Hiroshi Ueno, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第59回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Dissociation mechanism of IF1 from mitochondrial ATP synthase revealed by singlemolecule analysis and manipulation (2021)
  • Author(s): Ryohei Kobayashi, Hiroshi Ueno, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第59回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Functional analysis of ATPase complex in Type Three Secretion System of Enteropathogenic Escherichia coli (2021)
  • Author(s): Aya Suzuki, Yuki Tajimi, Ryo Kurosaki, Hiroshi Ueno, Takayuki Uchihashi, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第59回日本生物物理学会年会
• [Presentation] 1分子回転観察と操作によって解明されたミトコンドリア由来ATP合成酵素における阻害因子IF1の制御機構 (2021)
  • Author(s): 小林 稜平、上野 博史、野地 博行
  • Organizer: 第21回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] Functional analysis of ATPase complex in Type Three Secretion System of Enteropathogenic Escherichia coli (2021)
  • Author(s): Aya Suzuki, Yuki Tajimi, Ryo Kurosaki, Hiroshi Ueno, Takayuki Uchihashi, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第21回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] Rotary properties of hybrid F1-ATPases consisting of subunits from different species (2021)
  • Author(s): Ryo Watanabe, Mariel Zarco-Zavala, Busra Tas, Mayu Hara, Ryohei Kobayashi, Hiroshi Ueno, Jose J. Garcia-Trejo, Chun-Biu Li, Hiroyuki Noji
  • Organizer: 第21回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] ミトコンドリアATP合成酵素における制御因子IF1の一方向反応制御システムを司る分子基盤の探索 (2021)
  • Author(s): 小林 稜平、上野 博史、野地 博行
  • Organizer: 日本生体エネルギー研究会第47回討論会
• [Presentation] Cell-freeスクリーニングに向けたF1-ATPaseのin vitro合成及び1分子回転観察系の構築 (2021)
  • Author(s): 田口 真衣、上野 博史、野地 博行
  • Organizer: 日本生体エネルギー研究会第47回討論会
• [Remarks] 回転分子モーターの動きをコントロールする「留め金」はモーターの回転方向に依存して外れる
  • URL: https://www.appchem.t.u-tokyo.ac.jp/news/20230403-1/
• [Remarks] 酵素の分子個性のダイバーシティは酵素進化のバロメーターとなる
  • URL: https://www.appchem.t.u-tokyo.ac.jp/news/202302210-1/