Elucidation of working mechanisms of a molecular-engine complex responsible for protein membrane permeation by imaging of the conformational dynamics

• Project Area: Molecular Engine: Design of Autonomous Functions through Energy Conversion
• Project/Area Number: 21H00393
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 内橋 貴之 名古屋大学, 理学研究科, 教授 (30326300)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2023-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000); Fiscal Year 2022: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000); Fiscal Year 2021: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000)
• Keywords: 高速原子間力顕微鏡 / 一分子計測 / SecA / 膜輸送 / カドヘリン / タンパク質 / 構造変化 / 膜透過 / 膜タンパク質 / トランスロコン

Outline of Research at the Start

タンパク質の膜透過を担う膜タンパク質複合体は、細胞質にある基質タンパク質を掴んでチャネルに押し込み、さらに膜の逆側から引き抜くという、大きな構造変化を伴った複雑な動きにより機能を発揮する高次な発動分子複合体であると言える。本研究では、高速原子間力顕微鏡（AFM）および蛍光顕微鏡との複合機を駆使して、バクテリアのタンパク質膜透過装置Sec複合体が基質タンパク質を輸送する様子をリアルタイムに可視化し、さらに静止立体構造とのドッキングシミュレイションによる構造モデリングで、膜タンパク質透過の分子メカニズムを明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

SecYAEGの動態観察：　前年度に膜輸送時にはSecAの一部が構造変化している様子を観察することに成功した。今年度はSecYAEGのモデル構造に対して様々な方位で擬似AFM像を形成させることで実AFM像の観察方位を決定する解析法を開発し、既知のPPXDの構造変化(Open/Closed)と高速AFMで観察された構造変化の対応関係を明らかにした。さらに、ATPやADP・Pi、ADP結合状態を模擬する各種ヌクレオチドアナログ存在下でのPPXDの構造を解析し、PPXDの構造状態とATP加水分解サイクルの対応を明らかにするとともに、構造変化の頻度からATP加水分解活性を定量することに成功した。

細胞間接着分子カドヘリンのダイマー形成過程の観察
カドヘリンは隣り合う細胞表面に提示されたカドヘリンと互いに結合することで細胞と細胞をつなぐものの、一分子のスケールでのカドヘリンの結合機構には未だ明らかになっていない部分も多い。そこで、高速AFMを用いて溶液中におけるカドヘリンの結合構造および結合過程を一分子のスケールで直接可視化した。その結果、カドヘリンは複数の異なる形状のダイマーを形成していることがわかった。これらのダイマーの形状とダイナミクスを解析すると、結合界面を頻繁に変えながらダイマー形状が過渡的に変化するS形状ダイマー、ダイマー形状が変化しない安定したW形状ダイマー、同じく安定したcross形状ダイマーの3種類の構造に分類することが出来た。変異体の形状解析から、W形状ダイマーとcross形状ダイマーは、それぞれ従来から知られていたストランドスワップダイマーとXダイマーに対応することがわかった。一方、ダイマー形状がダイナミックに変化するS形状ダイマーは，ストランドスワップダイマーとXダイマーとは異なる新規のダイマー構造であることが明らかになった。

Research Progress Status

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Biosynthesis of highly branched gold nanoparticles through structural engineering of fatty acids (2023)
  • Author(s): Yue Youfeng、Yokota Yoshiko、Uchihashi Takayuki
  • Journal Title: iScience Volume: 26 Issue: 1 Pages: 105864-105864
  • DOI: 10.1016/j.isci.2022.105864
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] 3D Structure of Ring-shaped Microtubule Swarms Revealed by High-speed Atomic Force Microscopy (2023)
  • Author(s): Rashid Mst. Rubaya、Ganser Christian、Akter Mousumi、Nasrin Syeda Rubaiya、Kabir Arif Md. Rashedul、Sada Kazuki、Uchihashi Takayuki、Kakugo Akira
  • Journal Title: Chemistry Letters Volume: 52 Issue: 2 Pages: 100-104
  • DOI: 10.1246/cl.220491
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Decoding of the ubiquitin code for clearance of colliding ribosomes by the RQT complex (2023)
  • Author(s): Matsuo Yoshitaka、Uchihashi Takayuki、Inada Toshifumi
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 14 Issue: 1 Pages: 79-79
  • DOI: 10.1038/s41467-022-35608-4
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Disulfide Bond-mediated Oligomerization of a Green Fluorescent Protein in Solution (2023)
  • Author(s): Soon Julian Wong、Oohora Koji、Uchihashi Takayuki、Hayashi Takashi
  • Journal Title: Chemistry Letters Volume: 52 Issue: 2 Pages: 105-109
  • DOI: 10.1246/cl.220495
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Multiple dimeric structures and strand-swap dimerization of E-cadherin in solution visualized by high-speed atomic force microscopy (2022)
  • Author(s): Nishiguchi Shigetaka、Furuta Tadaomi、Uchihashi Takayuki
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 119 Issue: 30
  • DOI: 10.1073/pnas.2208067119
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Tip-scan high-speed atomic force microscopy with a uniaxial substrate stretching device for studying dynamics of biomolecules under mechanical stress (2022)
  • Author(s): Chan Feng-Yueh、Kurosaki Ryo、Ganser Christian、Takeda Tetsuya、Uchihashi Takayuki
  • Journal Title: Review of Scientific Instruments Volume: 93 Issue: 11 Pages: 113703-113703
  • DOI: 10.1063/5.0111017
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Clarification of Surface Deswelling of Thermoresponsive Microgels by Electrophoresis (2022)
  • Author(s): Nishizawa Yuichiro、Inui Takumi、Namioka Ryuji、Uchihashi Takayuki、Watanabe Takumi、Suzuki Daisuke
  • Journal Title: Langmuir Volume: 38 Issue: 51 Pages: 16084-16093
  • DOI: 10.1021/acs.langmuir.2c02742
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Lytic polysaccharide monooxygenase increases cellobiohydrolases activity by promoting decrystallization of cellulose surface (2022)
  • Author(s): Uchiyama Taku、Uchihashi Takayuki、Ishida Takuya、Nakamura Akihiko、Vermaas Josh V.、Crowley Michael F.、Samejima Masahiro、Beckham Gregg T.、Igarashi Kiyohiko
  • Journal Title: Science Advances Volume: 8 Issue: 51
  • DOI: 10.1126/sciadv.ade5155
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Shape-selective one-step synthesis of branched gold nanoparticles on the crystal surface of redox-active Pd^II-macrocycles (2022)
  • Author(s): Yamashita Yutaro、Tashiro Shohei、Ishii Yoshiki、Uchihashi Takayuki、Matsushita Nobuyuki、Kubota Ryou、Shionoya Mitsuhiko
  • Journal Title: Dalton Transactions Volume: 51 Issue: 4 Pages: 1318-1324
  • DOI: 10.1039/d1dt03973c
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Protein Needles Designed to Self‐Assemble through Needle Tip Engineering (2022)
  • Author(s): Kikuchi Kosuke、Fukuyama Tatsuya、Uchihashi Takayuki、Furuta Tadaomi、Maeda Yusuke T.、Ueno Takafumi
  • Journal Title: Small Volume: 18 Issue: 10 Pages: 2106401-2106401
  • DOI: 10.1002/smll.202106401
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Quantitative Visualization of the Interaction between Complement Component C1 and Immunoglobulin G: The Effect of CH1 Domain Deletion (2022)
  • Author(s): Yanaka Saeko、Nishiguchi Shigetaka、Yogo Rina、Watanabe Hiroki、Shen Jiana、Yagi Hirokazu、Uchihashi Takayuki、Kato Koichi
  • Journal Title: International Journal of Molecular Sciences Volume: 23 Issue: 4 Pages: 2090-2090
  • DOI: 10.3390/ijms23042090
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] JRAB/MICAL-L2 undergoes liquid-liquid phase separation to form tubular recycling endosomes (2021)
  • Author(s): Sakane Ayuko、Yano Taka-aki、Uchihashi Takayuki、Horikawa Kazuki、Hara Yusuke、Imoto Issei、Kurisu Shusaku、Yamada Hiroshi、Takei Kohji、Sasaki Takuya
  • Journal Title: Communications Biology Volume: 4 Issue: 1 Pages: 551-551
  • DOI: 10.1038/s42003-021-02080-7
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Reconstruction of Three-Dimensional Conformations of Bacterial ClpB from High-Speed Atomic-Force-Microscopy Images (2021)
  • Author(s): Bhaskar Dasgupta, Osamu Miyashita, Takayuki Uchihashi and Florence Tama
  • Journal Title: Frontiers in in Molecular Biosciences: Biological Modeling and Simulation Volume: 8 Pages: 704274-704274
  • DOI: 10.3389/fmolb.2021.704274
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Tardigrade Secretory-Abundant Heat-Soluble Protein Has a Flexible β-Barrel Structure in Solution and Keeps This Structure in Dehydration (2021)
  • Author(s): Kazuhisa Miyazawa, Satoru G. Itoh, Hiroki Watanabe, Takayuki Uchihashi, Saeko Yanaka, Maho Yagi-Utsumi, Koichi Kato, Kazuharu Arakawa, and Hisashi Okumura
  • Journal Title: Journal of Physical Chemistry B Volume: 125 Issue: 32 Pages: 9145-9154
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.1c04850
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Deformation of microtubules regulates translocation dynamics of kinesin (2021)
  • Author(s): Syeda Rubaiya Nasrin, Christian Ganser, Seiji Nishikawa, Arif Md Rashedul Kabir, Kazuki Sada, Takefumi Yamashita, Mitsunori Ikeguchi, Takayuki Uchihashi, Henry Hess, Akira Kakugo
  • Journal Title: Sci Adv Volume: 7 Issue: 42 Pages: 1-11
  • DOI: 10.1126/sciadv.abf2211
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Desiccation-induced fibrous condensation of CAHS protein from an anhydrobiotic tardigrade (2021)
  • Author(s): Yagi-Utsumi Maho、Aoki Kazuhiro、Watanabe Hiroki、Song Chihong、Nishimura Seiji、Satoh Tadashi、Yanaka Saeko、Ganser Christian、Tanaka Sae、Schnapka Vincent、Goh Ean Wai、Furutani Yuji、Murata Kazuyoshi、Uchihashi Takayuki、Arakawa Kazuharu、Kato Koichi
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 11 Issue: 1 Pages: 21328-21328
  • DOI: 10.1038/s41598-021-00724-6
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Construction of ferritin hydrogels utilizing subunit_subunit interactions (2021)
  • Author(s): Masaru Yamanaka, Tsuyoshi Mashima, Michio Ogihara, Mei Okamoto, Takayuki Uchihashi, and Shun Hirota
  • Journal Title: PLoS ONE Volume: 16 Issue: 11 Pages: e0259052-e0259052
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0259052
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Molecular Origin of the Anomalous pH Effect in Blue Proteorhodopsin (2021)
  • Author(s): Mizuki Sumikawa, Rei Abe-Yoshizumi, Takayuki Uchihashi, and Hideki Kandori
  • Journal Title: Journal of Physical Chemistry Letters Volume: 12 Issue: 51 Pages: 12225-12229
  • DOI: 10.1021/acs.jpclett.1c03355
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 高速原子間力顕微鏡の最近の応用展開と機能拡張 (2023)
  • Author(s): 内橋 貴之
  • Organizer: 日本顕微鏡学会バイオSPM研究会2022 -最新SPM計測技術とその応用展開：生体分子・細胞・組織-
  • Invited
• [Presentation] 高速原子間力顕微鏡の分子ダイナミクス計測への応用と機能拡張 (2023)
  • Author(s): 内橋 貴之
  • Organizer: 日本顕微鏡学会 第47回関東支部講演会「尖った顕微鏡計測の最前線」
  • Invited
• [Presentation] 高速原子間力顕微鏡を用いた生体/人工高分子のダイナミクス解析 (2023)
  • Author(s): 内橋 貴之
  • Organizer: 高分子のためのキャラクタリゼーションセミナー2022
  • Invited
• [Presentation] 高速原子間力顕微鏡による生体高分子の動的挙動観察 (2022)
  • Author(s): 内橋 貴之
  • Organizer: 第71回高分子討論会
  • Invited
• [Presentation] How to interpret movies of protein dynamics captured by high-speed AFM? ~ Significance of bridging experimental data and computational/mathematical simulations ~ (2022)
  • Author(s): T. Uchihashi
  • Organizer: 蛋白研セミナー：Frontier of Dynamic Structural Biology
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Dynamic Structural Biology Driven By High-Speed Atomic Force Microscopy (2022)
  • Author(s): T. Uchihashi
  • Organizer: ABA, APPA & TBS Joint Congress 2022
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Local mechanical indentation combined with high-speed AFM (2022)
  • Author(s): T. Uchihashi
  • Organizer: Workshop on Computational Biophysics of Atomic Force Microscopy : A Lecture Course Approach
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Dynamic Structural Biology Driven By High-Speed Atomic Force Microscopy (2022)
  • Author(s): T. Uchihashi
  • Organizer: Specialized iNANO Lecture
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] High-speed AFM observation of ring-shaped ATPase (2022)
  • Author(s): T. Uchihashi
  • Organizer: Symposium on Frontier Research for Disease-related Proteins and 2023 Korea-Japan Joint Meeting for Molecular Sciences
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 高速原子間力顕微鏡で可視化する生体/人工分子の一分子ダイナミクス (2022)
  • Author(s): 内橋貴之
  • Organizer: 明治薬科大学大学院フロンティアシンポジウム: 生命への架け橋
  • Invited
• [Presentation] 高速原子間力顕微鏡で撮影するタンパク質の機能動態 (2021)
  • Author(s): 内橋貴之
  • Organizer: 第21回 日本蛋白質科学会年会： WS5. 高速分子動画：タンパク質の構造機能相関研究の最先端
  • Invited
• [Presentation] 高速AFMによる高分子ゲル微粒子の構造物性動態イメージング (2021)
  • Author(s): 内橋貴之
  • Organizer: 第70回高分子討論会: S6. ソフトマテリアルイメージングの最前線
  • Invited
• [Book] "Microtubule Preparation for Investigation with High-Speed Atomic Force Microscopy": PART V: Analysis of Microtubule Dynamics and Structures, 22 in Microtubules : Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) (Hiroshi Inaba Ed.) (2022)
  • Author(s): Christian Ganser and Takayuki Uchihashi
  • Publisher: Springer
  • ISBN: 9781071619827
• [Book] 図説 表面分析ハンドブック (2021)
  • Author(s): 日本表面真空学会
  • Total Pages: 576
  • Publisher: 朝倉書店
  • ISBN: 9784254201703
• [Book] "Single-Molecule Methods Applied to Circadian Proteins with Special Emphasis on Atomic Force Microscopy": pp. 147-178 in Circadian Rhythms in Bacteria and Microbiomes (C. H, Johnson and M. J. Rust Eds) (2021)
  • Author(s): Tetsuya Mori and Takayuki Uchihashi,
  • Publisher: Springer
  • ISBN: 9783030721589
• [Book] 実験医学別冊 「創薬研究のための相互作用解析パーフェクト: 低中分子・抗体創薬におけるスクリーニング戦略と実例、in silico解析、一歩進んだ分析技術まで」(津本浩平，前仲勝実 編)： 第3章 ひとつ進んだ相互作用の理解をめざして: 5．高速原子間力顕微鏡によるタンパク質間動的相互作用の一分子計測 (2021)
  • Author(s): 内橋貴之
  • Total Pages: 368
  • Publisher: 羊土社
  • ISBN: 9784758122566