Imaging analysis of dynamic molecules using fluorescent probes

• Project Area: Molecular Engine: Design of Autonomous Functions through Energy Conversion
• Project/Area Number: 21H00401
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 蓑島 維文 大阪大学, 大学院工学研究科, 准教授 (20600844)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2023-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000); Fiscal Year 2022: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000); Fiscal Year 2021: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000)
• Keywords: 化学プローブ / 蛍光イメージング / 蛋白質ラベル化 / 1分子イメージング / プロトンポンプ / 蛍光プローブ / タンパク質標識

Outline of Research at the Start

本研究では、発動分子となるタンパク質複合体の動態・機能を直接観察するためのタンパク質蛍光標識技術の開発とイメージング解析への応用を行う。これまでに開発したタンパク質を可逆、非可逆に標識する手法のタイミング、濃度の制御のしやすさ、高い特異性、機能性の付与といった利点を活かし、回転運動によりプロトンを膜を隔てて輸送するプロトンポンプや歩行するように運動し細胞内の物質輸送を行うモータータンパク質の解析法へ応用する。

Outline of Annual Research Achievements

蛍光イメージングは発動分子となるタンパク質複合体の機能・動態を直接観察する手法として強力なツールである。本研究では化学に基づいて機能性蛍光プローブをタグとなるタンパク質を介し共有結合、非共有結合で標識する技術を活用し、発動分子となるタンパク質複合体の動態と機能を計測するためのツールを開発する。
第一に、外部エネルギー源を駆動力として回転運動により膜を隔ててプロトンを輸送するプロトンポンプの動態と機能を生細胞内で可視化解析することを目的とした。pHプローブをタンパク質にラベル化し、局所に固定化して計測する手法を構築できたため、その応用研究を進めた。まずは生細胞におけるラベル化とイメージングを行い、プローブがラベル化できることを確認した。次にpH変化を計測する系として、エネルギーの枯渇した飢餓状態においてタンパク質が低pHオルガネラであるリソソームへ移行する過程の可視化を試みた。標識のためにβラクタマーゼをタグ付けしたGFPを細胞内に発現し、pH応答性プローブでラベル化後、飢餓状態に晒した。その結果、時間経過とともにリソソームにあたる区画からプローブ由来の輝点が観察され、pH変化の可視化を達成した。
第二の目的として、繰り返しタンパク質に標識できる蛍光プローブを用い、1分子イメージングを利用した発動分子動態の長距離トラッキング解析を行った。前年度までに繰り返し標識できる蛍光プローブを用いた1分子イメージングが可能であることが分かっていたため、分子モーターとしてはたらくキネシンへタグを介して標識を行った。ATPを加えることでキネシンが微小管上を動く様子を可視化することができた。また、プローブ濃度を上げて常時入れ替わる状態にすることで、動かない状態ではあるが長時間1分子イメージングができることを実証した。

Research Progress Status

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Development of a Versatile Protein Labeling Tool for Live‐Cell Imaging Using Fluorescent β‐Lactamase Inhibitors (2023)
  • Author(s): Minoshima Masafumi、Umeno Taro、Kadooka Kohei、Roux Margaux、Yamada Namiko、Kikuchi Kazuya
  • Journal Title: Angewandte Chemie International Edition Volume: 62 Issue: 18
  • DOI: 10.1002/anie.202301704
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] JAK inhibition ameliorates bone destruction by simultaneously targeting mature osteoclasts and their precursors (2023)
  • Author(s): Yari et al.
  • Journal Title: Inflammation and Regeneration Volume: 43 Issue: 1 Pages: 18-18
  • DOI: 10.1186/s41232-023-00268-4
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Recent Advances in Activatable 19F Magnetic Resonance Imaging Nano‐Probes for the Detection of Biomarkers (2022)
  • Author(s): Salaam Jeremy、Minoshima Masafumi、Kikuchi Kazuya
  • Journal Title: Analysis & Sensing Volume: 3 Issue: 4
  • DOI: 10.1002/anse.202200081
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Hybrid, dual visible and near-infrared fluorescence emission of (6,5) single-walled carbon nanotubes modified with fluorescein through aryl diazonium salt chemistry (2022)
  • Author(s): Tomczyk Mateusz Michal、Minoshima Masafumi、Kikuchi Kazuya、Blacha-Grzechnik Agata、Starosolski Zbigniew、Bhavane Rohan、Zalewski Mariusz、Kuznik Nikodem
  • Journal Title: Nanotechnology Volume: 34 Issue: 5 Pages: 055703-055703
  • DOI: 10.1088/1361-6528/ac9c6a
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Photoinitiator‐Free Two‐Photon Polymerization of Biocompatible Materials for 3D Micro/Nanofabrication (2022)
  • Author(s): Nakayama Atsushi、Kumamoto Yasuaki、Minoshima Masafumi、Kikuchi Kazuya、Taguchi Atsushi、Fujita Katsumasa
  • Journal Title: Advanced Optical Materials Volume: 10 Issue: 18 Pages: 2200474-2200474
  • DOI: 10.1002/adom.202200474
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Efficient visible/NIR light-driven uncaging of hydroxylated thiazole orange-based caged compounds in aqueous media (2022)
  • Author(s): Hashimoto Ryu、Minoshima Masafumi、Sakata Souhei、Ono Fumihito、Ishii Hirokazu、Watakabe Yuki、Nemoto Tomomi、Yanaka Saeko、Kato Koichi、Kikuchi Kazuya
  • Journal Title: Chemical Science Volume: 13 Issue: 25 Pages: 7462-7467
  • DOI: 10.1039/d2sc02364d
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] pH‐Sensitive Polymethacrylates as Potential Contrast Agents in 19F MRI (2022)
  • Author(s): Zalewski Mariusz、Janasik Dawid、Kapala Anna、Minoshima Masafumi、Sugihara Fuminori、Raj Wojciech、Pietrasik Joanna、Kikuchi Kazuya、Krawczyk Tomasz
  • Journal Title: Macromolecular Chemistry and Physics Volume: 223 Issue: 14 Pages: 2200027-2200027
  • DOI: 10.1002/macp.202200027
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Cardioluminescence in Transgenic Zebrafish Larvae: A Calcium Imaging Tool to Study Drug Effects and Pathological Modeling (2021)
  • Author(s): Vicente Manuel、Salgado-Almario Jussep、Collins Michelle M.、Martinez-Sielva Antonio、Minoshima Masafumi、Kikuchi Kazuya、Domingo Beatriz、Llopis Juan
  • Journal Title: Biomedicines Volume: 9 Issue: 10 Pages: 1294-1294
  • DOI: 10.3390/biomedicines9101294
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Anti-Siglec-15 antibody suppresses bone resorption by inhibiting osteoclast multinucleation without attenuating bone formation (2021)
  • Author(s): Tsukazaki Hiroyuki、Kikuta Junichi、Ao Tomoka、Morimoto Akito、Fukuda Chie、Tsuda Eisuke、Minoshima Masafumi、Kikuchi Kazuya、Kaito Takashi、Ishii Masaru
  • Journal Title: Bone Volume: 152 Pages: 116095-116095
  • DOI: 10.1016/j.bone.2021.116095
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Development of Off-On Switching 19F MRI Probes for Cathepsin K Activity Detection (2021)
  • Author(s): Konishi Yuki、Okunishi Atsuya、Sugihara Fuminori、Nakamura Tatsuya、Akazawa Kazuki、Minoshima Masafumi、Kikuchi Kazuya
  • Journal Title: Bulletin of the Chemical Society of Japan Volume: 94 Issue: 6 Pages: 1690-1694
  • DOI: 10.1246/bcsj.20210099
  • NAID: 130008066557
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Near-infrared fluorescent probes: a next-generation tool for protein-labeling applications (2021)
  • Author(s): Reja Shahi Imam、Minoshima Masafumi、Hori Yuichiro、Kikuchi Kazuya
  • Journal Title: Chemical Science Volume: 12 Issue: 10 Pages: 3437-3447
  • DOI: 10.1039/d0sc04792a
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Development of 19F Magnetic Resonance Imaging Probe for in vivo Sensing Biomarkers (2022)
  • Author(s): Masafumi Minoshima
  • Organizer: ASBIC10
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] β-ラクタマーゼ阻害剤を用いた タンパク質ラベル化プローブの開発とオートファジー検出への応用 (2022)
  • Author(s): 蓑島維文、梅野太朗、門岡康平、菊地和也
  • Organizer: 日本ケミカルバイオロジー学会第16回年会
• [Presentation] 入れ替わり可能な蛍光プローブを用いた タンパク質標識法の開発 (2022)
  • Author(s): 蓑島維文、Shahi Imam Reja, 粟津利邦、神原丈敏、飯嶋康平、岨稔康、岡田康志、菊地和也
  • Organizer: 第16回バイオ関連化学シンポジウム
• [Presentation] 入れ替わり可能な蛍光標識法を利用した分子モーター解析 (2022)
  • Author(s): 蓑島維文
  • Organizer: 第11回分子モーター討論会
  • Invited
• [Presentation] Development of Optochemical Tools for Regulation of CREB-Dependent Transcriptional Activity (2021)
  • Author(s): Masafumi Minoshima, Takuma Imoto, Akihiro Kawase, Kazuya Kikuchi
  • Organizer: Pacifichem 2021
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 非対称シアニン色素を用いた可視光応答型ケージド化合物の開発 (2021)
  • Author(s): 蓑島維文、橋本龍、坂田宗平、小野富三人、菊地和也
  • Organizer: 第15回バイオ関連化学シンポジウム
• [Book] 先端の分析法 第2版（原理編第3章プローブ, MRIプローブ担当） (2022)
  • Author(s): 澤田 嗣郎、小澤 岳昌、北森 武彦、中村 洋（東京理科大学名誉教授）、藤浪 眞紀、宮村 一夫、石丸 洋一郎、浦野 泰照、加地 範匡、坂 真智子、鈴木 茂、瀬藤 光利、宗林 由樹、馬場 嘉信、船津 公人、本田 暁紀、末永 智一、宮野 博、本山 晃
  • Total Pages: 1072
  • Publisher: エヌ・ティー・エス
  • ISBN: 9784860437374
• [Patent(Industrial Property Rights)] タンパク質を蛍光標識する方法 (2023)
  • Inventor(s): 蓑島維文，飯嶋航平，Shahi Imam Reja，菊地和也
  • Industrial Property Rights Holder: 蓑島維文，飯嶋航平，Shahi Imam Reja，菊地和也
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2023-034762
  • Filing Date: 2023
• [Patent(Industrial Property Rights)] ケージド化合物から化合物を放出させる方法 (2021)
  • Inventor(s): 蓑島維文、橋本 龍、菊地和也
  • Industrial Property Rights Holder: 蓑島維文、橋本 龍、菊地和也
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2021-022014
  • Filing Date: 2021