生細胞内1分子FRET法による回転モータータンパク質のダイナミクス計測

• Project Area: Molecular Science for Supra Functional Systems ? Development of Advanced Methods for Exploring Elementary Process
• Project/Area Number: 22018018
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: The University of Tokyo (2011); Osaka University (2010)
• Principal Investigator: 飯野 亮太 東京大学, 大学院・工学系研究科, 講師 (70403003)
• Project Period (FY): 2010 – 2011
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2011)
• Budget Amount: ¥4,000,000 (Direct Cost: ¥4,000,000); Fiscal Year 2011: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000); Fiscal Year 2010: ¥2,000,000 (Direct Cost: ¥2,000,000)
• Keywords: 1分子計測 / 蛍光共鳴エネルギー移動 / 分子モーター / 1分子イメージング / ATP合成酵素 / FRET / 大腸菌

Research Abstract

固定子aサブユニットにSNAPタグ、回転子εサブユニットにCLIPタグを導入したF_oF_1に
Alexa647-benzylguanineおよびTMR-benzylcytosineを反応させ特異的結合を確認した。またリポソームに再構成した蛍光標識FoF1の1分子FRET計測を行い、回転子の向きを反映した3段階(L,M,H)のFRET効率が得られた。しかしながらFRETの経時変化計測では、一方向の回転に対応するL→M→H→Lといった順序だったFRET変化をみせた分子の割合は約20%と低く、L→M→Lのように2状態を可逆的に遷移する分子が多くみられた。この原因として、1)タグの位置が適切でなく蛍光色素の位置が一意に決まらない、2)リポソーム膜にきちんと再構成されていないFoF1の割合が高い、等の可能性が考えられた。1)の可能性を検証するため、タグの位置を変えたFoF1を様々に作製し改善を試みた。しかしながら現在までのところ大幅な改善には至っていない(1)。よって2)の可能性が高いと考えられた。
一方、大腸菌ではFoF1の細胞膜への再構成の効率は問題にする必要はない。そこで大腸菌での1分子計測を行うため、蛍光色素で標識後に菌体を培養し蛍光標識FoF1の密度を低下させた。その結果、細胞膜上を拡散する1分子FoF1の観察に成功した。しかしながら、Alexa647-benzylguanineの細胞膜透過性が低く、大腸菌内での1分子FRET計測には至らなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

予想と反し、順序だったFRET変化をみせた分子の割合は約20%と低く、L→M→Lのように2状態を可逆的に遷移する分子が多くみられた。Alexa647-benzylguanineの細胞膜透過性が低く、大腸菌内での1分子FRET計測には至らなかった。これらの点を解決する必要が生じたため、やや遅れていると判断した。

Strategy for Future Research Activity

光活性化蛍光タンパク質を用いた1分子FRET計測に取り組む。またFRET計測だけでなく、回転子と固定子に導入した2種の色素の向きを蛍光偏光で同時に1分子計測して回転速度を見積もる手法も試す。

Research Products

• [Journal Article] Principle role of the arginine finger in rotary catalysis of F1-ATPase (2012)
  • Author(s): Komoriya Y, Ariga T, Iino R, Imamura H, Okuno D, Noji H
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: (First published online) Issue: 18 Pages: 15134-15142
  • DOI: 10.1074/jbc.m111.328153
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] High-speed atomic force microscopy reveals rotary catalysis of rotorless F1-ATPase (2011)
  • Author(s): T. Uchihashi, R. Iino, T. Ando, and H. Noji
  • Journal Title: Science Volume: 333 Issue: 6043 Pages: 755-758
  • DOI: 10.1126/science.1205510
  • NAID: 120006575873
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Activation and stiffness of the inhibited states of F_1-ATPase probed by single-molecule manipulation. (2010)
  • Author(s): Saita E, Iino R, Suzuki T, Feniouk BA, Kinosita K.Jr, Yoshida M.
  • Journal Title: J Biol Chem. Volume: 285 Pages: 11411-11417
  • Peer Reviewed
• [Presentation] F1ナノモーターの1分子計測のこれから:観る、操作するを超えて (2012)
  • Author(s): 飯野亮太
  • Organizer: 財団法人新世代研究所2011年度第2回バイオ単分子研究会
  • Place of Presentation: 千葉(招待講演)
  • Year and Date: 2012-02-17
• [Presentation] 生体回転ナノモーターの1分子可視化計測 (2011)
  • Author(s): 飯野亮太
  • Organizer: H23年度日本分光学会生細胞分光部会シンポジウム
  • Place of Presentation: 横浜(神奈川県)(招待講演)
  • Year and Date: 2011-11-25
• [Presentation] Single-molecule imaging of ATP synthase in vitro and in living cells (2011)
  • Author(s): 飯野亮太
  • Organizer: 第49回日本生物物理学会年会シンポジウム,New experimental tools for structural changes of membrane proteins : Beyond X-ray structures
  • Place of Presentation: 姫路(兵庫県)(招待講演)
  • Year and Date: 2011-09-17
• [Presentation] Single-molecule FRET measurement of rotary motor protein dynamics in living cells (2011)
  • Author(s): Ryota Iino
  • Organizer: The 5th Symposium "Molecular Science for Supra Functional Systems"
  • Place of Presentation: Sapporo, Japan(招待講演)
  • Year and Date: 2011-07-13
• [Presentation] 分子モーターの性質を調べる1分子計測技術 (2011)
  • Author(s): 飯野亮太
  • Organizer: (社)日本電気計測器工業会 関西支部 第29回戦略的基盤技術検討委員会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 2011-02-07
• [Presentation] Subunit rotation in a single F_0F_1-ATP synthase in a living bacterium monitored by FRET. (2011)
  • Author(s): Seyfert K., Oosaka T., Yaginuma H., Ernst S.,, Noji H., Iino R., Borsch M.
  • Organizer: SPIE Photonics West 2011
  • Place of Presentation: サンフランシスコ、米国
  • Year and Date: 2011-01-22
• [Presentation] ATP合成酵素を1分子技術で視る・操る (2010)
  • Author(s): 飯野亮太
  • Organizer: 光塾第2回研究会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 2010-12-11
• [Presentation] Single-molecule studies on the fluctuation and function of a rotary motor protein ATP synthase (2010)
  • Author(s): Ryota Iino
  • Organizer: The 4th International Symposium "Molecular Science of Fluctuations toward Biological Functions"
  • Place of Presentation: 大津
  • Year and Date: 2010-11-30
• [Presentation] 1分子技術で生体回転ナノモーターを視る・操る (2010)
  • Author(s): 飯野亮太
  • Organizer: 特定領域研究「高次系分子科学」若手の会研究会
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2010-11-26
• [Book] Fundamental Properties and Structure of F_1-ATPase. In "Encyclopedia of Biophysics" edited by Roberts G.C. (2011)
  • Author(s): Okuno D, Iino R, Noji H.
  • Publisher: Springer (India)(In press)
• [Book] ATP synthase-Structure and dynamics of the smallest rotary motor proteins. In "Moleculaz Biology of Assemblies and Machines" edited by Baumeister W, Johnson L, Perham R, and Steven A. (2011)
  • Author(s): Noji H, Iino R.
  • Publisher: Garland (England)(In press)