イオンチャネルタンパク質KcsAのイオン透過に伴う分子形態変化観測

• Project Area: Molecular Science for Supra Functional Systems ? Development of Advanced Methods for Exploring Elementary Process
• Project/Area Number: 22018021
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 楯 真一 広島大学, 理学研究科, 教授 (20216998)
• Project Period (FY): 2010 – 2011
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2011)
• Budget Amount: ¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000); Fiscal Year 2011: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000); Fiscal Year 2010: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
• Keywords: 膜タンパク質 / NMR / KcsA / 構造ダイナミックス / 生物物理 / 生体分子 / 蛋白質

Research Abstract

KcsAの膜貫通部にのみ着目して,DIORITE法によるKcsAの閉構造状態・開構造状態での立体構造解析を目的として以下の実験を行った.
1. DIORITE解析のための分子配向条件の最適化:
昨年度までに膜貫通部のシグナル帰属を終えたため,今期はDIORITE法を用いた構造解析を中心にすすめた.特にhelix間の相対配向を決定するために必要な情報を得るために十分な強度で分子配向させる測定条件の探索を行った.最終的に,タンパク質濃度をかせぐために重水素標識をしないで^<15>N標識のみを適用した.また,解析に不要な膜貫通部以外のシグナルを消すために重水で調製した緩衝液を用いて測定を行った.最終的に最適な異方性圧縮アクリルアミドゲルの条件を決定でき,最大で8Hz程度の配向依存的なTROSYシグナル変化を観測できた.Helix間の配向変化を解析するための構造計算の準備を進めている段階である.
2. 開構造を安定にするための変異体調製:
我々の試料調製では,KcsAをSDSミセルで可溶化したサンプルを用いている.この条件では,良好な^1H-^<15>N相関シグナルを与えるために構造解析には適しているが,ゲートが開く酸性条件にするとKcsAの4量体構造が崩れて単量体になるという問題がある.このため,中性条件でゲートが開く変異体を用いてゲートの開構造を解析することを計画した.H25R/E118A/E120Aの3重変異体は中性付近で高頻度に開構造を取ることが分かっているが,大腸菌での発現が低くサンプルを大量に調製することが困難であった.次の候補として作成したE71A変異体では,十分な量のサンプルを得ることができたが,膜貫通部のみを残すサンプルとするために細胞内ドメインを切り出すと4量体が不安定になる問題が合った.H25Qでは,得られる資料の量・安定性ともに問題がなくこのサンプルを用いて研究を更に進める.

Research Products

• [Journal Article] Structural implication for the impaired binding of W150A mutant LOX-1 to oxidized low density lipoprotein, OxLDL (2012)
  • Author(s): S.Nakano, M.Sugiliara, R.Yamada, K.Katayanagi, S.Tate
  • Journal Title: Biochim.et Biophys.Acta. Volume: (In press) Issue: 5 Pages: 739-749
  • DOI: 10.1016/j.bbapap.2012.02.003
  • NAID: 120005308231
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Pressure dependence of activity and stability of dihydrofolate reductase of the deep-sea bacterium Moritella profunda and Eschericha coli (2012)
  • Author(s): E.Ohmae, C.Murakami, S.Tate, K.Gekko, K.Hata, K.Akasaka, C.Kato
  • Journal Title: Biochim.et Biophys.Acta. Volume: 1824 Issue: 3 Pages: 511-519
  • DOI: 10.1016/j.bbapap.2012.01.001
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Secondary-structure analysis of alcohol-denatured proteins by vacuum-ultraviolet circular dichroism spectroscopy (2012)
  • Author(s): M.Koichi, Y.Sakurada, S.Tate, H.Namatame, M.Taniguchi, K.Gekko
  • Journal Title: PROTEINS Volume: 80 Issue: 1 Pages: 281-293
  • DOI: 10.1002/prot.23206
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The NMR structure of FliK, the trigger for the switch of substrate specificity in the flagellar type III secretion appratus (2011)
  • Author(s): S.Mizuno, H.Amida, N.Kobayashi, S.Aizawa, S.Tate
  • Journal Title: J.Mol.Biol. Volume: 409 Issue: 4 Pages: 558-573
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2011.04.008
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The NMR structure of Flik, the trigger for the switch of substrate specificity in the flagellar type III secretion apparatus (2011)
  • Author(s): Mizuno, S., Amida, H., Kobayash, N., Aizawa, S., Tate, S
  • Journal Title: J.Mol.Biol. Volume: (In press)
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Surface plasmon resonance study on functional significance of clustered organization of lectin-like oxidized LDL (LOX-1) (2011)
  • Author(s): Ohki, I., Amida, H., Yamada, R., Sugihara, M., Ishigaki, T., Tate, S.
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta Volume: 1814 Pages: 345-354
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Comparative study on dihydrofolate reductases from Shewanella species living in deep-sea and ambient atmospheric-pressure environments (2011)
  • Author(s): Murakami, C., Ohame, E., Tate, S., Gekko, K., Nakasone, K., Kato, C.
  • Journal Title: Extremophiles Volume: 15 Pages: 165-175
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] NMRで観測する超高分子量タンパク質の分子形態 (2011)
  • Author(s): 楯真一
  • Journal Title: 生物物理 Volume: 51 Pages: 84-87
  • NAID: 10028105827
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Coupling effects of distal loops on structural stability and enzymatic activity of Escherichia coli dihydrofolate reductase revealed by deletion mutants (2010)
  • Author(s): Horiuchi, Y., Ohmae, E., Tate, S., Gekko, K.
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta Volume: 1804 Pages: 846-855
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cloning and characterization of dihydrofolate reductases from deep-sea bacteria (2010)
  • Author(s): Murakami, C., Ohame, E., Tate S., Gekko, K., Nakasone, K., Kato, C.
  • Journal Title: J.Biochem.(Tokyo) Volume: 147 Pages: 591-599
  • NAID: 10027875351
  • Peer Reviewed
• [Presentation] TAL effectorの結晶構造から明らかになったDNA認識機構-TALENデザインに向けた溶液構造解析の必要性 (2012)
  • Author(s): 楯真一
  • Organizer: 第1回ゲノム編集研究会
  • Place of Presentation: 広島(招待講演)
  • Year and Date: 2012-02-28
• [Presentation] NMRを用いた新しい膜タンパク質構造研究のアプローチ-KcsAの構造機能解析を目指して (2012)
  • Author(s): 楯真一
  • Organizer: 特定領域研究高次系分子科学ミニシンポジウムイオンチャネル研究の現状とこれからについて考える
  • Place of Presentation: 大阪(招待講演)
  • Year and Date: 2012-01-24
• [Presentation] Domain orientation dynamics revealed by alignment induced TROSY shift changes (2011)
  • Author(s): Shin-ichi Tate, Jun-ichi Uewaki, Naoko Utsunomiya-Tate
  • Organizer: ISNMR 2011
  • Place of Presentation: Yokohama, Japan
  • Year and Date: 2011-11-17
• [Presentation] Protein structural dynamics modulaiton induced by a mutation to flexible loop (2011)
  • Author(s): Shin-ichi Tate
  • Organizer: 日本生物物理学会第49回年会
  • Place of Presentation: 兵庫(招待講演)
  • Year and Date: 2011-11-16
• [Presentation] Prepared domain orientation of tandem HMG boxes defined by the inter-domain linker in HMGB2 (2011)
  • Author(s): Jun-ichi Uewaki, Jun-ichi Kurita, Naoko-Utsunomiya Tate, Shin-ichi Tate
  • Organizer: 日本生物物理学会第49回年会
  • Place of Presentation: 兵庫
  • Year and Date: 2011-11-16
• [Presentation] CH-π相互作用が規定するタンパク質の動的平衡構造 (2011)
  • Author(s): 上脇隼一, 楯直子, 楯真一
  • Organizer: 2011年日本化学会西日本大会
  • Place of Presentation: 兵庫
  • Year and Date: 2011-11-12
• [Presentation] DNA結合により誘導されるタンパク質のドメイン配向変化の定量的観測 (2011)
  • Author(s): 竹内彩, 上脇隼一, 楯真一
  • Organizer: 2011年日本化学会西日本大会
  • Place of Presentation: 兵庫
  • Year and Date: 2011-11-12
• [Presentation] タンパク質の内部運動性と機能制御 (2011)
  • Author(s): 楯真一
  • Organizer: 「理論と実験」研究会2011
  • Place of Presentation: 広島(招待講演)
  • Year and Date: 2011-10-07
• [Presentation] Functional regulation through phosphorylation to acidic intrinsically disordered region in FACT as a chromatin remodeling factor (2011)
  • Author(s): S.Tate
  • Organizer: Annual meeting of Protein Science Japan, co-sponsored Asia Pacific Protein Association
  • Place of Presentation: Osaka, Japan(招待講演)
  • Year and Date: 2011-06-07
• [Presentation] Determination of the alignment tensor of protein by orientation induced TROSY shift changes (2011)
  • Author(s): Shin-ichi Tate
  • Organizer: Gordon Research Conference Computational Aspects-Biomolecular NMR
  • Place of Presentation: Lucca, Italy
  • Year and Date: 2011-05-25
• [Presentation] クロマチンリモデリングタンパク質のリン酸化による機能制御機構の解明 (2011)
  • Author(s): 橋本愛美, 松井理恵子, 上脇隼一, 津中康央, 森川耿右, 楯真一
  • Organizer: 第52回日本生化学会中国四国支部例会
  • Place of Presentation: 広島
  • Year and Date: 2011-05-24
• [Presentation] 酸化LDL受容体タンパク質LOX-1の基質認識機構の解明 (2011)
  • Author(s): 杉原守, 山田梨紗都, 編田宏一, 楯真一
  • Organizer: 日本生物物理学会第3回中国四国支部大会
  • Place of Presentation: 広島
  • Year and Date: 2011-05-15
• [Presentation] タンパク質構造情報利用技術としてのNMR-結晶構造解析に対する補完的利用 (2011)
  • Author(s): 楯真一
  • Organizer: よこはまNMR構造生物学研究会第41回ワークショップ
  • Place of Presentation: 理研, 横浜(招待講演)
  • Year and Date: 2011-03-02
• [Presentation] Alteration to internally correlated motion in protein by the mutation to a loop region (2010)
  • Author(s): Shin-ichi Tate
  • Organizer: Pacifi Chem.2010
  • Place of Presentation: Honolulu, USA(招待講演)
  • Year and Date: 2010-12-18
• [Presentation] Preferential domain orientation in HMGB2 protein revealed by NMR spectroscopy (2010)
  • Author(s): Jun-ichi Uewaki, Naoko Tate, Shin-ichi Tate
  • Organizer: PacifiChem.2010
  • Place of Presentation: Honolulu, USA
  • Year and Date: 2010-12-18
• [Presentation] クロマチンリモデリング因子FACTのリン酸化による機能制御機構 (2010)
  • Author(s): 松井理恵子, 橋本愛美, 上脇隼一, 津中康央, 森川耿右, 楯真一
  • Organizer: 第33回日本分子生物学会年会・第83日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2010-12-09
• [Presentation] Exploring the ligand-binding mechanism of LOX-1 by surface plasmon resonance (2010)
  • Author(s): 山田梨紗都, 編田宏一, 大木出, 楯真一
  • Organizer: 第33回日本分子生物学会年会・第83日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2010-12-08
• [Presentation] NMR analysis on the changes of structural dynamics and functions induced by loop mutations in DHFR (2010)
  • Author(s): 和田侑士, 堀内祐司, 大前英司, 楯真一
  • Organizer: 第33回日本分子生物学会年会・第83日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2010-12-08
• [Presentation] HMGB2タンパク質に含まれる2つのドメイン相対配向とリンカーの役割 (2010)
  • Author(s): 上脇隼一, 楯直子, 楯真一
  • Organizer: 第49回NMR討論会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2010-11-17
• [Presentation] べん毛フック長さ制御タンパク質FliKのNMR構造解析 (2010)
  • Author(s): 水野志乃, 編田宏一, 小林直宏, 藤原敏道, 相沢慎一, 楯真一
  • Organizer: 第49回NMR討論会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2010-11-17
• [Presentation] Protein structure determination using orientation induced TROSY shift changes (2010)
  • Author(s): Shin-ichi Tate
  • Organizer: 第49回NMR討論会
  • Place of Presentation: 東京
  • Year and Date: 2010-11-16
• [Presentation] 異方性スピン相互作用を用いた新規NMR法によるPin1の基質依存的な構造変化解析 (2010)
  • Author(s): 廣口典輝, 堀内佑司, 白木拓磨, 楯真一
  • Organizer: 日本化学会西日本大会
  • Place of Presentation: 熊本大学, 熊本
  • Year and Date: 2010-11-06
• [Presentation] HMGB2タンパク質に含まれる2つのドメイン相対配向とリンカーの役割 (2010)
  • Author(s): 上脇隼一, 楯直子, 楯真一
  • Organizer: 日本生物物理学会第48回年会
  • Place of Presentation: 東北大学, 仙台
  • Year and Date: 2010-09-20
• [Presentation] べん毛フックの長さ制御因子FliKのNMRによる構造解析 (2010)
  • Author(s): 水野志乃, 楯真一, 相沢慎一
  • Organizer: 日本生物物理学会 第48回年会
  • Place of Presentation: 東北大学, 仙台
  • Year and Date: 2010-09-20
• [Presentation] 異方性スピン相互作用を用いた新規NMR法によるPin1の基質依存的な構造変化解析 (2010)
  • Author(s): 廣口典輝, 堀内佑司, 白木拓磨, 楯真一
  • Organizer: 日本生物物理学会第48回年会
  • Place of Presentation: 東北大学, 仙台
  • Year and Date: 2010-09-20
• [Presentation] クロマチンリモデリングタンパク質のリン酸化による構造機能制御機構の解明 (2010)
  • Author(s): 橋本愛美, 松井理恵子, 上脇隼一, 津中康央, 森川耿右, 楯真一
  • Organizer: 日本生物物理学会第48回年会
  • Place of Presentation: 東北大学, 仙台
  • Year and Date: 2010-09-20
• [Presentation] クロマチンリモデリングタンパク質のリン酸化による構造機能制御機構の解明 (2010)
  • Author(s): 橋本愛美, 松井理恵子, 上脇隼一, 楯真一
  • Organizer: 日本生物高分子学会年会
  • Place of Presentation: 兵庫県立大学, 兵庫
  • Year and Date: 2010-09-18
• [Presentation] 高磁場NMRを用いる蛋白質の動的構造解析の可能性 (2010)
  • Author(s): 楯真一
  • Organizer: 大阪大学蛋白質研究所セミナー超高磁場が拓く生体系NMR
  • Place of Presentation: 阪大, 大阪(招待講演)
  • Year and Date: 2010-07-30
• [Presentation] Alignment induced TROSY shift changes applied to protein structure determination (2010)
  • Author(s): Shin-ichi Tate
  • Organizer: WWMR2010
  • Place of Presentation: Florence, Italy
  • Year and Date: 2010-07-05
• [Presentation] 溶液中での高分子量タンパク質分子形態変化観測のためのNMR技術 (2010)
  • Author(s): 楯真一
  • Organizer: 第10回蛋白質化学会年会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター,札幌(招待講演)
  • Year and Date: 2010-06-17
• [Presentation] NMRによるヌクレオソームシャペロンタンパク質HMGB2のリンカーに制御されるドメイン相対配向 (2010)
  • Author(s): 上脇隼一, 森内寛, 楯直子, 楯真一
  • Organizer: 第51回日本生化学会中国・四国支部例会
  • Place of Presentation: 山口大学, 山口
  • Year and Date: 2010-05-14
• [Presentation] クロマチンリモデリングタンパク質のリン酸化による構造機能制御機構の解明 (2010)
  • Author(s): 橋本愛美, 松井理恵子, 上脇隼一, 楯真一
  • Organizer: 第2回日本生物物理学会中国四国支部例会
  • Place of Presentation: 愛媛大学, 愛媛
  • Year and Date: 2010-05-09
• [Book] Current trends in X-ray crystallography Chandrasekaran, A ed.Chap.18 "Complementary use of NMR to X-ray crystallography for the analysis of protein morphological change in solution" pp409-436 (2011)
  • Author(s): S.Tate, A.Imada, N.Hiroguchi
  • Total Pages: 436
  • Publisher: InTech
• [Book] 広がるNMRの世界(朝倉哲朗 編)(章著:タンパク質の分子形態変化の観測) (2011)
  • Author(s): 楯真一
  • Total Pages: 182
  • Publisher: コロナ社
• [Patent(Industrial Property Rights)] 酸化LDL受容体に作用するリポソーム (2012)
  • Inventor(s): 町田幸子、倉持みゆき、楯真一、山田梨紗都
  • Industrial Property Rights Holder: 町田幸子、倉持みゆき、楯真一、山田梨紗都
  • Industrial Property Number: 2012-072404
  • Filing Date: 2012-03-27