イオンチャネルタンパク質KcsAのイオン透過に伴う分子形態変化観測
Publicly Offered Research
| Project Area | Molecular Science for Supra Functional Systems ? Development of Advanced Methods for Exploring Elementary Process |
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| Project/Area Number |
22018021
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Science and Engineering
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
楯 真一 広島大学, 理学研究科, 教授 (20216998)
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| Project Period (FY) |
2010 – 2011
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2011)
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| Budget Amount *help |
¥3,600,000 (Direct Cost: ¥3,600,000)
Fiscal Year 2011: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
Fiscal Year 2010: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
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| Keywords | 膜タンパク質 / NMR / KcsA / 構造ダイナミックス / 生物物理 / 生体分子 / 蛋白質 |
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| Research Abstract |
KcsAの膜貫通部にのみ着目して,DIORITE法によるKcsAの閉構造状態・開構造状態での立体構造解析を目的として以下の実験を行った.
1. DIORITE解析のための分子配向条件の最適化:
昨年度までに膜貫通部のシグナル帰属を終えたため,今期はDIORITE法を用いた構造解析を中心にすすめた.特にhelix間の相対配向を決定するために必要な情報を得るために十分な強度で分子配向させる測定条件の探索を行った.最終的に,タンパク質濃度をかせぐために重水素標識をしないで^<15>N標識のみを適用した.また,解析に不要な膜貫通部以外のシグナルを消すために重水で調製した緩衝液を用いて測定を行った.最終的に最適な異方性圧縮アクリルアミドゲルの条件を決定でき,最大で8Hz程度の配向依存的なTROSYシグナル変化を観測できた.Helix間の配向変化を解析するための構造計算の準備を進めている段階である.
2. 開構造を安定にするための変異体調製:
我々の試料調製では,KcsAをSDSミセルで可溶化したサンプルを用いている.この条件では,良好な^1H-^<15>N相関シグナルを与えるために構造解析には適しているが,ゲートが開く酸性条件にするとKcsAの4量体構造が崩れて単量体になるという問題がある.このため,中性条件でゲートが開く変異体を用いてゲートの開構造を解析することを計画した.H25R/E118A/E120Aの3重変異体は中性付近で高頻度に開構造を取ることが分かっているが,大腸菌での発現が低くサンプルを大量に調製することが困難であった.次の候補として作成したE71A変異体では,十分な量のサンプルを得ることができたが,膜貫通部のみを残すサンプルとするために細胞内ドメインを切り出すと4量体が不安定になる問題が合った.H25Qでは,得られる資料の量・安定性ともに問題がなくこのサンプルを用いて研究を更に進める.
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Report
(2 results)
Research Products
(45 results)
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[Journal Article] The NMR structure of Flik, the trigger for the switch of substrate specificity in the flagellar type III secretion apparatus2011
Author(s)
Mizuno, S., Amida, H., Kobayash, N., Aizawa, S., Tate, S
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Journal Title
J.Mol.Biol.
Volume: (In press)
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[Journal Article] Surface plasmon resonance study on functional significance of clustered organization of lectin-like oxidized LDL (LOX-1)2011
Author(s)
Ohki, I., Amida, H., Yamada, R., Sugihara, M., Ishigaki, T., Tate, S.
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Journal Title
Biochimica et Biophysica Acta
Volume: 1814
Pages: 345-354
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[Journal Article] Comparative study on dihydrofolate reductases from Shewanella species living in deep-sea and ambient atmospheric-pressure environments2011
Author(s)
Murakami, C., Ohame, E., Tate, S., Gekko, K., Nakasone, K., Kato, C.
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Journal Title
Extremophiles
Volume: 15
Pages: 165-175
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[Journal Article] Cloning and characterization of dihydrofolate reductases from deep-sea bacteria2010
Author(s)
Murakami, C., Ohame, E., Tate S., Gekko, K., Nakasone, K., Kato, C.
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Journal Title
J.Biochem.(Tokyo)
Volume: 147
Pages: 591-599
NAID
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