| Project Area | Protein community: organization and maintenance of protein functions |
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| Project/Area Number |
22020006
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Biological Sciences
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
飯塚 怜 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助教 (90541954)
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| Project Period (FY) |
2010 – 2011
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2011)
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| Budget Amount *help |
¥4,800,000 (Direct Cost: ¥4,800,000)
Fiscal Year 2011: ¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000)
Fiscal Year 2010: ¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000)
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| Keywords | シャペロニン / リボソーム / 1分子蛍光イメージング / 光ピンセット / 翻訳アレスト |
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| Research Abstract |
1.シャペロニンGroELの機能・相互作用解析
当初の計画を変更し,フットボール型GroEL-GroES複合体の両側のリングでGFPがフォールディングする様子をリアルタイムにイメージングすることを試みた.変性GFPを捕捉したGroEL D398A変異体をガラス基板上に固定し,GroESおよびcaged ArPを添加した.紫外光照射によりArPを生成させたところ,両側のリングにGFPの蛍光が出現する様子が観察された.紫外光照射からGFPの蛍光が出現するまでの時間を解析したところ,GFPのフォールディングは2段階の反応を経て進行し,そのキネティクスは弾丸型複合体内で起こる反応と全く同じであることが分かった.
2.リボソームの機能・相互作用解析
(1)翻訳開始段階の1分子力学測定
昨年度までに1分子破断力測定により,30Sサブユニット-mRNA-開始tRNA複合体に開始因子2(IF2)および50Sサブユニットを共存させると,30Sサブユニット-mRNA間相互作用が安定化することを見出した.本年度はこの分子基盤を探り,IF2が開始tRNAおよび50Sサブユニットと協同で30Sサブユニット-mRNA間相互作用を安定化することを突き止めた.以上の成果をまとめ,米国科学アカデミー紀要に発表した.
(2)翻訳アレスト段階の1分子力学測定
無細胞タンパク質翻訳系でC末端にSecMのアレスト配列を有するHaloTagタンパク質を合成し,リボソーム-SecMアレスト配列間の相互作用の破断力測定を行った,その結果破断力は,平均20pNであった.またアレスト配列・終止コドンを持たないコンストラクトについて同様の実験を行ったところ,破断力は平均22pNとなった.以上の結果から,SecMの翻訳アレストは20pNよりも弱い力で解除されることが示唆された.現在,新たな実験系での測定を試みている.
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「シャペロニンGroELの機能・相互作用解析」および「翻訳開始段階の1分子力学測定」については,ほぼ計画通りに研究を遂行することができ,当初の目標を達成することができた.その成果は,米国生化学分子生物学会誌および米国科学アカデミー紀要に掲載された.「翻訳アレスト段階の1分子力学測定」については,当初想定していた実験系では測定が難しいことが判明し,現在新たな実験系での測定を試みている.
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| Strategy for Future Research Activity |
当初計画に盛り込んでいなかったが,「シャペロニンGroELの機能・相互作用解析」において,フットボール型複合体の両側のリングで起こる基質タンパク質のフォールディングをリアルタイムに観察することに成功した.今後は,この研究成果をさらに発展させていきたい.また,ポリマー製ナノホールアレイデバイスを用いた新たな1分子イメージング法を開発した.加えて,フェムトリットル体積の溶液チャンバー内で酵素1分子の活性を測定することに成功した.これらの手法を,GroELの機能・相互作用解析に応用していきたいと考えている.
「翻訳アレスト段階の1分子力学測定」については,リボソーム複合体に一定の負荷を与えながら翻訳アレストの解除に要する時間の測定を試みている.今後も引き続き,この研究に取り組んでいきたい.
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