翻訳途上鎖のタンパク質社会における意義と役割

• Project Area: Protein community: organization and maintenance of protein functions
• Project/Area Number: 22020035
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Kyoto Sangyo University
• Principal Investigator: 伊藤 維昭 京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (90027334)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 千葉 志信 京都産業大学, 総合生命科学部, 助教 (20523517)
• Project Period (FY): 2010 – 2011
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2011)
• Budget Amount: ¥6,400,000 (Direct Cost: ¥6,400,000); Fiscal Year 2011: ¥3,200,000 (Direct Cost: ¥3,200,000); Fiscal Year 2010: ¥3,200,000 (Direct Cost: ¥3,200,000)
• Keywords: リボソーム / 翻訳制御 / 蛋白質 / 合成途上鎖 / ポリペプチジル-tRNA / 翻訳アレスト / SecM / MifM

Research Abstract

細胞内の合成途上鎖を特異的に検出する方法を開発した。細胞の全タンパク質を中性pHのSDS-PAGE(Invitrogen Nu-PAGE)で分離すると、その中に含まれる合成途上鎖はインタクトなpolypeptidy1-tRNAとして泳動される。ゲルのレーンを切り出して弱アルカリ性高温でインキュベートするとペプチドとtRNAとを結ぶエステル結合が切れる。Polypeptidyl-tRNAの安定性を系統的に調べたところ、最後のアミノ酸がVal,Ile,Proの場合は、かなり加水分解に抵抗性であることがわかった。これらの加水分解が充分に起こるように、強アルカリ・高温度処理を行うとゲル中のタンパク質がアクリルアミド成分と反応して2次元目の泳動が不可能となった。最適条件として1M Tris-base-80℃処理を設定した。切り出したゲルレーンを2次元目のゲルの上端に横たえて泳動すると、タンパク質一般は対角線上に並ぶが、Polypeptidyl-tRNAは、tRNAが存在するため1次元目の移動度が単純ポリペプチドに比べて約18kDa相当分遅れる。tRNAが失われた2次元目では移動が昂進する。この方法により、合成途上鎖のpolypeptide部分を対角線の下側のラインとして翻訳を完了した一般のタンパク質から分離して検出することが可能となった。この方法を用いた解析により、大腸菌細胞において、リボソーム救援機構が欠損するとpolypeptidyl-tRNAの数パーセントが安定に存続することが明らかになった。

Research Products

• [Journal Article] Nascentome analysis uncovers futile protein synthesis in Escherichia coli (2012)
  • Author(s): Ito K., et al
  • Journal Title: PLoS ONE Volume: 6 Issue: 12 Pages: e28413-e28413
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0028413
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Recruitment of a species-specific arrest module to monitor different cellular processes (2011)
  • Author(s): Chiba, S., et al
  • Journal Title: Proc.Natl.Acad.Sci, USA Volume: 108 Issue: 15 Pages: 6073-6078
  • DOI: 10.1073/pnas.1018343108
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] tructure and function of SecDF, a protein export-enhancing membrane component (2011)
  • Author(s): Tsukazaki, T., et al
  • Journal Title: Nature Volume: 475 Issue: 7350 Pages: 235-238
  • DOI: 10.1038/nature09980
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Recruitment of a species-specific translational arrest module to monitor different cellular processes (2011)
  • Author(s): Chiba, S.
  • Journal Title: Proceeding of National Acadamey of Sciences, USA Volume: 108(in press)
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A translational pause to localize (2011)
  • Author(s): Ron, D.
  • Journal Title: Science Volume: 331 Pages: 543-544
• [Journal Article] Divergent stalling sequences sense and control cellular physiology (2010)
  • Author(s): Ito, K.
  • Journal Title: Biochemical Biophysical Research Communications Volume: 393 Pages: 1-5
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Structure, function and regulation of bacterial Sec machinery (2011)
  • Author(s): 伊藤維昭
  • Organizer: International Union of Microbiological Societies 2011 Congress
  • Place of Presentation: 札幌(招待講演)
• [Presentation] Vsualization of cellular polypeptidyl-tRNAs uncovers futile protein synthesis in E.coli (2011)
  • Author(s): 伊藤維昭
  • Organizer: Cold Spring Harbor Asia Conference Protein Homeostasis in Health and Disease
  • Place of Presentation: Suzhou, China(招待講演)
• [Presentation] Visualizing dynamic "nascentome" of the cell (2010)
  • Author(s): 伊藤維昭
  • Organizer: International Symposium on Protein Community
  • Place of Presentation: 奈良
  • Year and Date: 2010-09-14
• [Presentation] 枯草菌翻訳アレスト因子mifMのin vitro翻訳系による解析 (2010)
  • Author(s): 千葉志信
  • Organizer: 平成22年度グラム陽性菌ゲノム会議.
  • Place of Presentation: 南木曾
  • Year and Date: 2010-09-03
• [Presentation] Visualizing dynamic nascentome of the cell. (2010)
  • Author(s): 伊藤維昭
  • Organizer: FASEB Summer Research Conference Protein Folding in the Cell
  • Place of Presentation: Vermont(USA)
  • Year and Date: 2010-07-27
• [Remarks]
  • URL: http://www.cc.kyoto-su.ac.jp/~k4563/index-j.html
• [Remarks]
  • URL: http://www.kyoto-su.ac.jp/department/nls/news/20111208_news.html
• [Remarks]
  • URL: http://www.kyoto-su.ac.jp/department/nls/news/20110328_news.html
• [Remarks]
  • URL: http://www.cc.kyoto-su.ac.jp/-k4563/index-j.html