抗原受容体遺伝子の対立遺伝子排除による自己形成の分子基盤

• Project Area: Immunological Self Recognition and its Disorders
• Project/Area Number: 22021021
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 縣 保年 京都大学, 医学研究科, 准教授 (60263141)
• Project Period (FY): 2010 – 2012
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2011)
• Budget Amount: ¥9,600,000 (Direct Cost: ¥9,600,000); Fiscal Year 2011: ¥4,800,000 (Direct Cost: ¥4,800,000); Fiscal Year 2010: ¥4,800,000 (Direct Cost: ¥4,800,000)
• Keywords: 遺伝子発現 / エピジェネティクス / 染色体ダイナミクス / クロマチン / E2A転写因子 / 遺伝子再構成 / コヒーシン / CTCF

Research Abstract

我々は抗原受容体遺伝子再構成に関して研究を行ない、転写因子E2Aが組換え部位に直接結合し、ヒストンアセチル化を上昇させ組換えを誘導することや、片方のアリルで機能的な組換えが成功するとE2Aの抑制因子であるId3が誘導され、E2Aが組換え部位から解離することによってもう片方のアリルの組換えが抑制されることを明らかにした。さらに染色体領域を可視化する3D-FISHによりTCRβ遺伝子座の伸縮状態を解析したところ、染色体上に離れて存在するV領域とDJ領域は、組換えが起きる段階で接近し、組換えが抑制されると離れること,さらにE2Aを過剰発現させると組換えが抑制される段階でも両領域が接近し、組換えが誘導されることを見出した。
染色体のルーヒ.ングに関しては、CTCFや、染色体分配に関わるコヒーシン等の蛋白が関与することが示唆されている。そこでTCRβ遺伝子座におけるこれらの蛋白の結合状態を調べた結果、コヒーシンがE2Aの結合様式とよく相関して、組換えの起きる時期特異的に結合することがわかった。さらに培養細胞を用いてコヒーシンのサブユニットをノックダウンすると、組換えが阻害されることがわかった。そこでコヒーシンのサブユニットSmc3のfloxマウスを、様々な分化段階で欠失可能な各種Creマウスと交配することにより、in vivoでのコヒーシンのT細胞分化と遺伝子再構成における役割を検討している。
一方、より高解像度で染色体構造を解析するために、Chromosome Conformation Capture(3C)アッセイを立ち上げ解析したところ、V領域は組換えが起きる段階でDJ領域と接近し、間に存在するトリプシノゲン遺伝子とは接近しないことから、染色体ルーピングが起きていると考えられた。この3Cアッセイにより、E2Aの過剰発現が染色体ルーピングを誘導できるかさらに検討している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

E2Aによる染色体ルーピングを媒介する分子機構の解析において、コヒーシンが、E2Aの結合様式とよく相関して、組換えの起きる時期特異的にTCRβ遺伝子に結合することを見出すことができた。さらに培養細胞を用いてコヒーシンのサブユニットをノックダウンすると、組換えが阻害されたことから、さらにin vivoでのコヒーシンのT細胞分化と遺伝子再構成における役割を明らかにするために、コヒーシンのサブユニットSmc3のfloxマウスを、様々な分化段階で欠失可能な各種Creマウスと交配している。

Strategy for Future Research Activity

染色体構造をより高解像度で解析するために、Chromosome Conformation Capture(3C)アッセイを立ち上げ解析したところ、V領域が組換えの起きる時期特異的に染色体ルーピングにより、DJ領域と接近することを見出した。現在、E2Aの過剰発現が染色体ルーピングを誘導できるかこの方法によりさらに検討しているが、この3Cアッセイには、比較的多数の細胞が必要なため、新たに胸腺細胞特異的E2Aトランスジェニックマウスを作製し、解析を行なっている。

Research Products

• [Journal Article] Imatinib mesylate directly impairs class switch recombination through downregulation of AID. (2012)
  • Author(s): Kawamata T, Lu J, Sato T, Tanaka M, Nagaoka H, Agata Y, Toyoshima T, Yokoyama K, Oyaizu N, Nakamura N, Ando K, Tojo A, Kotani A
  • Journal Title: Blood Volume: 119 Issue: 13 Pages: 3123-3127
  • DOI: 10.1182/blood-2011-01-327932
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The opposing roles of the transcription factor E2A and its antagonist Id3 that orchestrate and enforce the naive fate of T cells. (2011)
  • Author(s): Miyazaki M, Rivera RR, Miyazaki K, Lin YC, Agata Y, Murre C
  • Journal Title: Nat Immunol. Volume: 12 Issue: 10 Pages: 992-1001
  • DOI: 10.1038/ni.2086
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Regulation of TCR Vγ2 gene rearrangement by the helix-loop-helix protein, E2A. (2011)
  • Author(s): Nozaki M, Wakae K, Tamaki N, Sakamoto S, Ohnishi K, Uejima T, Minato N, Yanagihara I, Agata Y
  • Journal Title: I lit Immunol. Volume: 23 Issue: 5 Pages: 297-305
  • DOI: 10.1093/intimm/dxr005
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Regulation of TCR Vγ2 gene rearrangement by the helix-loop-helix protein, E2A (2011)
  • Author(s): Nozaki M, Wakae K, Tamaki N, Sakamoto S, Ohnishi K, Uejima T, Minato N, Yanagihara I, Agata Y
  • Journal Title: Int Immunol Volume: 23 Pages: 297-305
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Claudin-4 induction by E-protein activity in later stages of CD4/8 double-positive thymocytes to increase positive selection efficiency (2011)
  • Author(s): Kawai Y, Hamazaki Y, Fujita H, Fujita A, Sato T, Furuse M, Fujimoto T, Jetten AM, Agata Y, Minato N
  • Journal Title: Proc Natl Acad Sci USA Volume: 108 Pages: 4075-4080
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 発生段階特異的なTCRγ遺伝子再構成における転写抑制因子Gfi-1の役割 (2011)
  • Author(s): 若江亨祥、坂本修士、山下政克、中山俊憲、湊長博、縣保年
  • Organizer: 第19回Kyoto T Cell Conference
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 2011-06-11
• [Presentation] Regulation of Vγ2 gene rearrangement by the helix-loop-helix protein, E2A (2010)
  • Author(s): Nozaki M, Tamaki N, Sakamoto S, Yanagihara I, Agata Y
  • Organizer: 14^<th> International Congress of Immunology
  • Place of Presentation: 神戸市、日本
  • Year and Date: 2010-08-26
• [Presentation] E2A negatively regulates TCR Vγ3 rearrangement viatranscriptional repressor, Gfi-1 (2010)
  • Author(s): Wakae K, Sakamoto S, Yamashita M, Nakayama T, Minato N, Agata Y
  • Organizer: 14^<th> International Congress of Immunology
  • Place of Presentation: 神戸市、日本
  • Year and Date: 2010-08-26
• [Presentation] bHLH転写因子E2AによるVγ2遺伝子再構成の制御機構 (2010)
  • Author(s): 野崎昌俊、柳原格、縣保年
  • Organizer: Kyoto T Cell Conference
  • Place of Presentation: 京都市、日本
  • Year and Date: 2010-06-04
• [Presentation] E2A and CBP/p300 act in synergy to promote chromatin accessibility of the immunoglobulin κ locus in nonlymphoid cells (2010)
  • Author(s): Agata Y
  • Organizer: Gene Expression & Signaling in the Immune System
  • Place of Presentation: Cold Spring Harbor, USA
  • Year and Date: 2010-04-22