変性構造転移による膜蛋白質シグナル伝達機構の固体ＮＭＲによる解明

• Project Area: Target recognition and expression mechanism of intrinsically disordered protein
• Project/Area Number: 22113512
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 藤原 敏道 大阪大学, たんぱく質研究所, 教授 (20242381)
• Project Period (FY): 2010 – 2011
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2011)
• Budget Amount: ¥12,480,000 (Direct Cost: ¥9,600,000、Indirect Cost: ¥2,880,000); Fiscal Year 2011: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000); Fiscal Year 2010: ¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000)
• Keywords: 核磁気共鳴 / 膜蛋白質 / 膜タンパク質 / 変性構造

Research Abstract

ppR二量体および ppR・pHtrII複合体など膜蛋白質の変性領域について固体ＮＭＲ法で解析を行った。その複合体の試料調製で、必要な数mgの安定同位体標識試料を作り、機能のある状態で脂質二重膜へ再構成した。対象の分子量が約10万と大きく、NMR感度が十分でないため、固体ＮＭＲの新しい非線形サンプリングなどの手法で分解能・感度を向上させる。構造解析では、ＮＭＲプロテオミクス研究や計算機科学の最先端の技術として、データベースに基づくＮＭＲスペクトルシミュレーション法と脂質膜を考慮したレプリカ交換動力学法を組み合わせて利用した。この方法論を確立した。複合体を活性状態に転移させるために、超伝導磁石内のＮＭＲ試料に光照射できるよう装置を改造すした。特にpHtrIIの水溶性領域の天然変性構造の変化に注目してＮＭＲ測定するために、Ｊ結合相関に基づく高速試料回転多次元ＮＭＲ法や電子スピンとの距離測定法も開発して応用した。

Current Status of Research Progress

Reason

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

24年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Secondary Structural Analysis of Proteins Based on 13C Chemical Shift Assignments in Unresolved Solid-State NMR Spectra Enhanced by Fragmented Structure Database (2013)
  • Author(s): Keisuke Ikeda, Ayako Egawa, and Toshimichi Fujiwara
  • Journal Title: J. Biomol. NMR, Volume: 55 Pages: 189-200
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Helium-Cooling and -Spinning Dynamic Nuclear Polarization for Sensitivity-Enhanced Solid-State NMR at 14 T and 30 K (2012)
  • Author(s): Yoh Matsuki, Keisuke Ueda, Toshitaka Idehara, Ryosuke Ikeda, Isamu Ogawa, Shinji Nakamura, Mitsuru Toda, Takahiro Anai, Toshimichi Fujiwara
  • Journal Title: J. Magn. Reson. Volume: 225 Pages: 1-9
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Combined use of replica-exchange molecular dynamics and magic-angle-spinning solid-state NMR spectral simulations for determining the structure and orientation of membrane-bound peptide (2011)
  • Author(s): Keisuke Ikeda, Tomoshi Kameda, Erisa Harada, Hideo Akutsu, and Toshimichi Fujiwara
  • Journal Title: J. Phys. Chem. B Volume: 115 Pages: 9327-9336
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Combined use of replica-exchange molecular dynamics and magic-angle-spinning solid-state NMR spectral simulations for determining the structure and orientation of membrane-bound peptide (2011)
  • Author(s): Keisuke Ikeda, Tomoshi Kameda, Erisa Harada, Hideo Akutsu, Toshimichi Fujiwara
  • Journal Title: J.Phys.Chem.B Volume: 115 Pages: 9327-9336
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structure analysis of membrane-reconstituted subunit c-ring of E.coli H^+-ATP synthase by solid-state NMR under MAS (2010)
  • Author(s): Yasuto Todokoro, Masatoshi Kobayashi, Takeshi Sato, Toru Kawakami, Ikuko Yumen, Saburo Aimoto, Toshimichi Fujiwara, Hideo Akutsu
  • Journal Title: J.Biomol.NMR Volume: 48 Pages: 1-11
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Continuously Frequency Tunable High Power Sub-THz Radiation Source-Gyrotron FU CW VI for 600 MHz DNP-NMR spectroscopy (2010)
  • Author(s): Yoh Matsuki, Hiroki Takahashi, Keisuke Ueda, Toshitaka Idehara, Isamu Ogawa, Mitsuru Toda, Hideo Akutsu, Toshimichi Fujiwara
  • Journal Title: Phys.Chem.Chem.Phys. Volume: 12 Pages: 5799-5803
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 固体NMR法を用いた生理的環境での膜蛋白質pHtrIIの構造解析 (2012)
  • Author(s): 江川文子，池田恵介，Lili Mao，林こころ，児嶋長次郎，井上正順，藤原敏道
  • Organizer: NMR討論会
  • Place of Presentation: 名古屋ウインク愛知
  • Invited
• [Presentation] Automated Signal Assignment and Secondary Structural Analysis of Non-Crystalline Proteins by Fragment-Based Solid-State NMR Spectral Reconstruction (2012)
  • Author(s): Keisuke Ikeda, Ayako Egawa, Kokoro Hayashi, Chojiro Kojima, Toshimichi Fujiwara
  • Organizer: NMR討論会
  • Place of Presentation: 名古屋ウインク愛知
  • Invited
• [Presentation] Solid-state NMR structural analysis of membrane proteins and sensitivity enhancement (2010)
  • Author(s): Toshimichi Fujiwara
  • Organizer: Pachifi Chem 2010
  • Place of Presentation: Convention Center, Honolulu(米国)(招待講演)
  • Year and Date: 2010-12-15
• [Presentation] 固体NMRスペクトルシミュレーションによる高度好塩菌由来トランスデューサー膜蛋白質pHtrIIの動的構造解析 (2010)
  • Author(s): 池田恵介、江川文子、亀田倫史、林こころ、児嶋長次郎、阿久津秀雄、藤原敏道
  • Organizer: 第49回NMR討論会
  • Place of Presentation: タワーホール船堀、東京
  • Year and Date: 2010-11-16
• [Presentation] 多次元固体NMRによる膜蛋白質pHtrIIの主鎖構造解析 (2010)
  • Author(s): 江川文子、林こころ、児嶋長次郎、阿久津秀雄、藤原敏道
  • Organizer: 第48回日本生物物理学会
  • Place of Presentation: 東北大学川内北キャンパス
  • Year and Date: 2010-09-21
• [Remarks] 蛋白質研究所機能構造計測学研究室
  • URL: http://www.protein.osaka-u.ac.jp/biophys/