天然変性構造を持つEGF受容体分子認識ドメインの1分子構造ダイナミクス解析

• Project Area: Target recognition and expression mechanism of intrinsically disordered protein
• Project/Area Number: 22113523
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 佐甲 靖志 独立行政法人理化学研究所, 佐甲細胞情報研究室, 主任研究員 (20215700)
• Project Period (FY): 2010 – 2011
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2011)
• Budget Amount: ¥11,700,000 (Direct Cost: ¥9,000,000、Indirect Cost: ¥2,700,000); Fiscal Year 2011: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000); Fiscal Year 2010: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000)
• Keywords: 1分子計測 / 蛋白質 / 構造ダイナミクス / 蛍光共鳴エネルギー移動 / 細胞増殖因子

Research Abstract

上皮成長因子受容体(EGFR)分子認識ドメインの構造ダイナミクスを1分子解析し、細胞内情報処理における役割の理解を目指して研究を行った。EGFRはチロシンキナーゼ型細胞膜受容体であり、天然変性状態にある細胞質末端約220アミノ酸残基の分子認識ドメインで細胞質蛋白質と多状態相互作用する。本研究では、分子認識ドメインの構造分布と構造状態遷移ダイナミクスを、蛍光相関分光計測(FCS)および2チャンネルタイムスタンプ法による単一分子内FRET検出を用いて計測した。大腸菌でリコンビナント精製した分子認識ドメインのアミノ末端を蛍光色素Alexa488で標識し、FCS計測したところ、溶液中で単量体として自由拡散運動し、有効半径は5.3nmであることが示された。既存の蛋白質データの半径と分子密度の関係と比較し、分子認識ドメインはほとんど変性状態にあることが予想された。アミノ末端から約70残基の位置にあるシステインを蛍光色素Alexa555でさらに標識し、アミノ末端のAlexa488との間で分子内FRET計測を行った。溶液中の1分子計測では、一部の分子群にエネルギー移動効率0.3を中心とする広い範囲のFRET信号が得られた。これは分子の構造分布が広がっていることを示し、構造状態がエントロピックに安定化していること、すなわちランダムコイル状態(変性状態)であることを示唆している。カルボキシ末端に導入したヒスチジンタグを用いて分子を基盤に固定し、1分子のFRET効率変化を5msの時間分解能で計測したところ、分子ごとに異なった効率を示すものの、個々の分子の構造は数秒にわたってほぼ一定していることが示された。多数分子の平均分布は溶液中と一致していた。まれに2状態転移を示す分子が観察された。分子認識ドメインの構造多状態性は、認識相手との多状態相互作用の分子基盤となっていると考えられる。

Research Products

• [Journal Article] Single-molecule kinetic analysis of RAF activation in the ternary complex among RAF, RasGTP, and the kinases on the plasma membrane of living cells (2011)
  • Author(s): Hibino, K., Shibata, T., Yanagida, T., Sako, Y.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. Volume: 286 Pages: 36460-36468
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Live cell single-molecule detection in systems biology (2011)
  • Author(s): Sako, Y, Hiroshima, M., Pack, C.-G., Okamoto, K., Hibino, K., Yamamoto, A.
  • Journal Title: WIREs Systems Biology and Medicine Volume: 4 Issue: 2 Pages: 183-192
  • DOI: 10.1002/wsbm.161
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 細胞内情報処理反応とそのゆらぎ:蛋白質の1分子反応計測 (2011)
  • Author(s): 佐甲靖志
  • Journal Title: 光アライアンス Volume: 22 Pages: 8-11
• [Journal Article] [PSI^+] aggregate enlargement in rn91 non-prion domain mutants, leading to a loss-of-prion yeast. (2011)
  • Author(s): Kurahashi, H., et al.
  • Journal Title: Genes to Cells. Volume: (印刷中)
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 細胞内1分子計測とシステムズバイオロジー (2010)
  • Author(s): 日比野佳代, 他
  • Journal Title: 細胞工学 Volume: 29 Pages: 344-348
• [Presentation] 生体高分子ダイナミクスの1分子計測 (2012)
  • Author(s): 佐甲靖志
  • Organizer: 天然変性タンパク質の分子認識機構と機能発現第2回公開シンポジウム
  • Place of Presentation: 千里ライフサイエンスセンター(豊中)(招待講演)
  • Year and Date: 2012-01-25
• [Presentation] Single-molecule time-stamp measurements of the dynamics of intrinsically disordered proteins (2011)
  • Author(s): Sako, Y.
  • Organizer: 第34回日本分子生物学会年会Workshop "Functions of the intrinsically disordered regions found in various proteins"
  • Place of Presentation: Pacifico Yokohama (Yokohama)(招待講演)
  • Year and Date: 2011-12-14
• [Presentation] 細胞内情報処理システムの1分子計測 (2011)
  • Author(s): 佐甲靖志
  • Organizer: 第32回数理医学研究会講演
  • Place of Presentation: 大阪大学(豊中)(招待講演)
  • Year and Date: 2011-12-02
• [Presentation] 1分子反応計測に駆動されたErbB受容体システムの動作解析 (2011)
  • Author(s): 佐甲靖志
  • Organizer: 第84回日本生化学会大会シンポジウム「データ駆動型システム生物学」
  • Place of Presentation: 京都国際会議場(京都)(招待講演)
  • Year and Date: 2011-09-21
• [Presentation] 細胞内反応とそのゆらぎ (2011)
  • Author(s): 佐甲靖志
  • Organizer: 光エレクトロニクス第130委員会創立50周年記念シンポジウム
  • Place of Presentation: 森戸記念館(東京)(招待講演)
  • Year and Date: 2011-07-08
• [Presentation] 細胞情報蛋白質の分子間相互作用 (2010)
  • Author(s): 佐甲靖志
  • Organizer: 大阪大学蛋白質研究所セミナー
  • Place of Presentation: 吹田
  • Year and Date: 2010-10-21
• [Presentation] Raman spectroscopy for non-invasive microscopic analysis of biological systems and single live cells. (2010)
  • Author(s): Morita, et al.
  • Organizer: 日本生物物理学会第48回年会
  • Place of Presentation: 仙台
  • Year and Date: 2010-09-20
• [Book] Cell Signaling Reactions : Single-molecule Kinetic Analyses (2010)
  • Author(s): Sako, Y., Ueda, M.eds.
  • Total Pages: 330
  • Publisher: Springer
• [Remarks]
  • URL: http://www.riken.go.jp/cell-info/
• [Remarks]
  • URL: http://www.riken.go.jp/cell-info/