真核細胞におけるRNAサイレンシングの構造基盤の解明

Publicly Offered Research

Project Area	Functional machinery for non-coding RNAs
Project/Area Number	22115504
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
Allocation Type	Single-year Grants
Review Section	Biological Sciences
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	西増弘志 The University of Tokyo, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (00467044)
Project Period (FY)	2010
Project Status	Completed (Fiscal Year 2011)
Budget Amount *help	¥8,840,000 (Direct Cost: ¥6,800,000、Indirect Cost: ¥2,040,000) Fiscal Year 2011: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000) Fiscal Year 2010: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
Keywords	タンパク質 / 核酸 / 結晶構造
Research Abstract	ショウジョウバエに由来するAUB,AGO3を含むPiwiサブファミリーArgonauteタンパク質のN末端に存在する特定のアルギニン残基が対称的ジメチル化アルギニン(sDMA)修飾され,Tudor(Tud)タンパク質とsDMA依存的に結合することで生殖細胞におけるレトロトランスポゾン抑制に関与する.その分子機構の解明を目指して,ショウジョウバエに由来するTud(11個のTudorドメインを含む)の複数の領域をHisタグ融合タンパク質として大腸菌で発現させ,NiNTAカラムで精製し,sDMAAUB,および.sDMAAGO3ビオチン化ペプチドとストレプトアビジンビーズを用いてプルダウン実験を行った.その結果,特定のTudorドメインを含むいくつかの領域がsDMAAUBやsDMAAGO3ペプチドと結合することがわかった.それらのコンストラクションを大腸菌で大量発現(2.5L)させ,NiNTAカラム,イオン交換カラム,ゲルろ過カラムを用いて高純度に精製した.精製タンパク質を用いてsDMAAUBやsDMAAGO3ペプチドの存在下で結晶化スクリーニングを行い,いくつかのコンストラクションに関して結晶を得ることに成功した.結晶化条件の最適化を行い,X線回折実験が可能な結晶を得た.それらの結晶を用いてSPring-8BL41XUでX線回折実験を行ったが,構造解析には十分な分解能の回折データを得ることはできなかった.そこで結晶性の改良を目指しさらなるコンストラクションや結晶化条件の最適化を行った.