一分子FRET法による分子モータータンパク質の動的複合体形成過程の観察

• Project Area: Integrative understanding of biological processes mediated by transient macromolecular complexes; New technology for visualizing physiologically metastable states.
• Project/Area Number: 22121504
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 富重 道雄 東京大学, 大学院・工学系研究科, 准教授 (50361530)
• Project Period (FY): 2010 – 2011
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2011)
• Budget Amount: ¥11,180,000 (Direct Cost: ¥8,600,000、Indirect Cost: ¥2,580,000); Fiscal Year 2011: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000); Fiscal Year 2010: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
• Keywords: 分子モーター / 生物物理学 / 一分子計測(SMD) / 分子機械 / ナノマシン

Research Abstract

本年度は、昨年度の研究により加水分解活性が大きく低下することが示されたネックリンカー変異体をさらに詳しく解析することにより、キネシンが二足歩行運動中に前後の頭部の活性を制御するアロステリックな構造基盤を明らかにすることを目的とする。まず、ネックリンカー上の疎水残基1325をGlyに置換したキネシン単頭変異体のATP加水分解速度の低下の原因を探るために、ストップドフロー装置を用いて各加水分解ステップの反応速度を計測した。頭部の微小管への結合速度、微小管結合に伴う頭部からのADPの解離速度、および頭部へのATPの結合速度は野生型とほとんど変わらなかったのに対して、ATP加水分解に伴う微小管からの頭部の解離速度は約10倍低下した。これらの結果は、1325G変異体は野生型と比べて、ATP結合もしくは加水分解のステップが遅くなっていることを示すものである。次に1325G変異体のATP加水分解反応が低下する構造基盤を明らかにするために、クライオ電子顕微鏡を用いて微小管に結合した1325G変異体の構造を観察した。ATPアナログであるAMPPNP存在下での1325Gの構造を9Åの分解能で観察したところ、AMPPNPがヌクレオチド結合部位に結合しているもののネックリンカーは頭部にドッキングしておらず、また野生型キネシンのATP結合前の状態に相当する頭部が回転していない状態に近い構造状態を取っていることが分かった。これらの結果は、ATP結合に伴う頭部の回転にはネックリンカーの疎水側鎖と頭部との相互作用が必要であり、ネックリンカーが頭部と相互作用できない(前足の状態に相当)場合には、頭部が回転できずにATP加水分解反応が抑制される、という頭部間の協調的な制御機構を示唆するものである。

Research Products

• [Presentation] The neck linker of kinesin-1 functions as a regulator of ATP hydrolysis reaction (2012)
  • Author(s): Xiao Ling
  • Organizer: 56th Annual Meeting of Biophysical Society
  • Place of Presentation: San Diego, CA, USA
  • Year and Date: 2012-02-27
• [Presentation] Role of the neck linker on the front head gating mechanism of kinesin-1 (2011)
  • Author(s): Xiao Ling
  • Organizer: The 17th International Biophysics Congress
  • Place of Presentation: Beijing, China
  • Year and Date: 2011-11-02
• [Presentation] Structural basis for the coordinated walking mechanism of kinesin motorprotein (2011)
  • Author(s): Michio Tpmishige
  • Organizer: IMS Symposium on "Recent Development of Spectroscopy and Spatial and Temporal Hierarchical Structures in Molecular Science
  • Place of Presentation: Institute for Molecular Science, Okazaki(招待講演)
  • Year and Date: 2011-10-18
• [Presentation] キネシンの協調的二足歩行メカニズム (2011)
  • Author(s): 富重道雄
  • Organizer: 第1回分子モーター討論会
  • Place of Presentation: 東京大学本郷キャンパス(招待講演)
  • Year and Date: 2011-06-22
• [Presentation] Role of the neck linker on the front head gating mechanism of kinesin-1 (2011)
  • Author(s): Xiao Ling
  • Organizer: 55th Annual Meeting of Biophysical Society
  • Place of Presentation: Baltimore, MD, USA
  • Year and Date: 2011-03-06
• [Presentation] Coordinated walking mechanism of kinesin motor protein studied by structural and single molecule analyses (2011)
  • Author(s): Michio Tomishige
  • Organizer: 1st Korea University- The University of Tokyo Joint Workshop on Bio-Soft Matter
  • Place of Presentation: Koshiba Hall, Univ.of Tokyo
  • Year and Date: 2011-02-23
• [Presentation] Role of the neck linker on the front head gating mechanism of kinesin-1 (2011)
  • Author(s): Xiao Ling
  • Organizer: 1st Korea University- The University of Tokyo Joint Workshop on Bio-Soft Matter
  • Place of Presentation: Koshiba Hall, Univ.of Tokyo
  • Year and Date: 2011-02-22
• [Presentation] Structural basis of kinesin's processivity (2011)
  • Author(s): Xiao Ling
  • Organizer: 25th Anniversary Symposium of the Protein Society
  • Place of Presentation: Boston, MA, USA
• [Presentation] キネシン1のネックリンカーはATP加水分解を制御する役割を担う (2010)
  • Author(s): 凌霄
  • Organizer: 日本生物物理学会第48回年会
  • Place of Presentation: 東北大学川内キャンパス
  • Year and Date: 2010-09-20
• [Presentation] 統合的な構造機能解析による分子モータータンパク質の研究 (2010)
  • Author(s): 富重道雄
  • Organizer: 名古屋大学工学研究科テクノ・シンポジウム「生物物理の未来研究会」
  • Place of Presentation: 名古屋大学ベンチャービジネスラボラトリー
  • Year and Date: 2010-09-11
• [Presentation] ネックリンカーによるキネシンのATP加水分解反応の制御 (2010)
  • Author(s): 凌霄
  • Organizer: 第10回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター
  • Year and Date: 2010-06-18