Publicly Offered Research
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
昨年度の研究により、Alexa594でラベルしたロドプシンからメタIとメタIIの平衡状態を生成させ、この試料について1分子蛍光観測をすると蛍光強度がステップ状の増減を繰り返すことがわかった。この実験結果と可視吸収スペクトル法での結果を詳細に解析した結果、メタIとメタIIの状態がそれぞれGタンパク質を活性化する構造としない構造の2状態になっていることを発見した。また、7員環レチナールを加えて光反応を起こらなくしたロドプシンやタンパク質部分のみ(オプシン)の1分子蛍光観測をした結果、増減の頻度は低いがこれらも2状態になることがわかった。さらに、各状態のGタンパク質活性化効率を測定したところ、蛍光増減の起こる頻度と相関を示すことを見いだした。また、2状態間の蛍光強度の葦はロドプシンおよびオプシンのほうが大きい可能性が示唆された。これらの結果を現在論文としてまとめている。また、リガンドが結合しなくてもGタンパク質活性化能を示す変異体(構成的活性変異体)について、上記と同様の実験を行うことを試みた。培養細胞で発現させた野生型ロドプシンでは、外節膜中のロドプシンに比べてラベル化効率が非常に低かった。そこで、ラベル化条件を最適化したところ、ROS中のロドプシンと同様に、蛍光強度によって活性構造をとらえることができた。構成的活性変異体も同じ条件で蛍光ラベルされることが確認できたので、今後は、1分子蛍光観測を行う予定である。一方、Gタンパク質のC末端ペプチド(11残基)とメタIIとの結合を利用して複合体での1分子FRET観測も試みた。しかし、ドナーの消光、あるいはアクセプターの発光で両者の結合を観測することは現在成功していない。これは、1分子観測では非常に低濃度の試料牽用いているためにペプチドとメタIIの結合効率が低いことも一因であると考えられるので、より高濃度での観測を行っている。
All 2012 2011 2010 Other
All Journal Article (7 results) (of which Peer Reviewed: 7 results) Presentation (3 results) Remarks (2 results)
Biochemistry
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10.1021/bi2018283
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http://photo1.biophys.kyoto-u.ac.jp/
http://photol.biophys.kyoto-u.ac.jp/
