単一細胞内セカンドメッセンジャー代謝動態のリアルタイム計測

• Project Area: Integrative understanding of biological processes mediated by transient macromolecular complexes; New technology for visualizing physiologically metastable states.
• Project/Area Number: 22121510
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 森井 孝 京都大学, エネルギー理工学研究所, 教授 (90222348)
• Project Period (FY): 2010 – 2011
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2011)
• Budget Amount: ¥11,180,000 (Direct Cost: ¥8,600,000、Indirect Cost: ¥2,580,000); Fiscal Year 2011: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000); Fiscal Year 2010: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
• Keywords: セカンドメッセンジャー / イノシトールポリリン酸 / センサー / リセプター / PHドメイン

Research Abstract

本年度は、IP3センサーとIP4センサーによる細胞内IP3、IP4動態の同時計測を目的とした。
I.化学修飾により作製したIP3センサーとIP4センサーによる同時計測
ダンシル基を用いて作製したIP3センサーとフルオレセインを用いて作製したIP4センサーの励起波長は、それぞれ380nmと480nmである。IP3センサーとIP4センサーをHeLa細胞に同時に取り込ませて、細胞にヒスタミン刺激を加え、励起波長を380nmと480nmにスイッチングし、発光を520nmで観測することによりIP3センサーとIP4センサーの発光を単一細胞で計測した。同時測定の結果から、ヒスタミン刺激によりIP3とIP4は同期した細胞内濃度変化を示すことがわかった。
II.IP3センサー・IP4センサーを使用した細胞内IP3・IP4動態の解析
細胞内ではアゴニスト刺激に応じて一過的にカルシウム濃度が上昇し、この上昇に応答してIP3・IP4濃度変化が起こるとともに、細胞膜上でPIP3が産生されることが示唆されている。カルシウムとPIP3,IP3,IP4の動態と細胞内においてカルシウム濃度が周期的に変動する「オシレーション」の相関を明らかにするため、カルシウムオシレーションとPIP3、動態との相関を解明するため、細胞内カルシウム濃度をfluo3で測定し、カルシウムイオンとIP3、カルシウムイオンとIP4の動態を同時測定した。これにより、『単一細胞内で複数のセカンドメッセンジャーを同時測定する方法』を確立した。
III.cpGFPを融合したGRP1-PHドメインを用いた細胞内で発現可能なIP4センサーの構築
前年度計画と同様に、スプリットPHドメインをcpGFPに挿入する方法でIP4センサーの構築及び蛍光評価を行った。PHドメインとcpGFP間のリンカー長を変化させることによりIP4結合に伴う蛍光強度が変化したが、リンカー長と蛍光強度の間には相関性はなかった。

Research Products

• [Journal Article] Zinc-Finger Proteins for Site-Specific Protein Positioning on DNA-Origami Structures (2012)
  • Author(s): E.Nakata, FF Liew, C Uwatoko, S Kiyonaka, Y Mori, Y Katsuda, M Endo, H Sugiyama, T Morii
  • Journal Title: Angew Chem Int Ed Volume: 51 Issue: 10 Pages: 2421-2424
  • DOI: 10.1002/anie.201108199
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Positional effects of phosphorylation on the stability and the morphology of tau-related amyloid fibrils (2012)
  • Author(s): Masafumi Inoue、Takashi Konno、Kazuki Tainaka Eiji Nakata Hiro-o Yoshida Takashi Morii
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 51巻 Issue: 7 Pages: 1396-1406
  • DOI: 10.1021/bi201451z
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Design and synthesis of biotinylated inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate targeting Grp1 pleckstrin homology domain (2011)
  • Author(s): Anraku, K.; Inoue, T.; Sugimoto, K.; Kudo, K.; Okamoto, Y.; Morii, T.; Mori, Y.; Otsuka, M.
  • Journal Title: Bioorg.Med.Chem. Volume: 19 Issue: 22 Pages: 6833-6841
  • DOI: 10.1016/j.bmc.2011.09.035
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The mechanism of fibril formation of a non-inhibitory serpin ovalbumin revealed by the identification of amyloidogenic core regions (2011)
  • Author(s): Tanaka N, Morimoto Y, Noguchi Y, Tada T, Waku T, Kunugi S, Morii T, Lee YF, Konno T, Takahashi N.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. Volume: 286 Pages: 5584-94
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural Aspects for the Recognition of ATP by Ribonucleopeptide Receptors. (2011)
  • Author(s): Nakano, S., Mashima, T., Matsugami, A., Inoue, M., Katahira, M., Morii, T.
  • Journal Title: J.Am.Chem.Soc. Volume: 133 Pages: 4567-79
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] An in vitro fluorescent sensor reveals intracellular Ins(1,3,4,5)P_4 dynamics in single cells. (2010)
  • Author(s): Sakaguchi, R., Tainaka, K., Shimada, N., Nakano, S., Inoue, M., Kiyonaka, S., Mori, Y., Morii, T.
  • Journal Title: Angew.Chem.Int.Ed. Volume: 49 Pages: 2150-2153
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 細胞内シグナル伝達分子を可視化するケミカルバイオロジー・ツール (2011)
  • Author(s): 森井孝
  • Organizer: 熊本大学大学院薬学研究科セミナー
  • Place of Presentation: 熊本大学(熊本県)(招待講演)
  • Year and Date: 2011-11-25
• [Presentation] 準安定二重鎖を用いたRNA配列認識PNA蛍光センサー (2011)
  • Author(s): 松本桂彦・中田栄司・森井孝
  • Organizer: 第5回バイオ関連化学シンポジウム
  • Place of Presentation: つくば国際会議場「エポカルつくば」(茨城県)
  • Year and Date: 2011-09-12
• [Presentation] 高いDNA/RNA配列認識能を有するPNA蛍光センサー (2011)
  • Author(s): 松本桂彦・中田栄司・森井孝
  • Organizer: 生体関連化学部会若手の会第23回サマースクール
  • Place of Presentation: 広島グランドホテル有もと(広島県)
  • Year and Date: 2011-07-22
• [Presentation] RNPを用いたモジュール型蛍光センサーの作製 (2011)
  • Author(s): 田村友樹・仲野瞬・中田栄司・森井孝
  • Organizer: 生体関連化学部会若手の会第23回サマースクール
  • Place of Presentation: 広島グランドホテル有もと(広島県)
  • Year and Date: 2011-07-22
• [Presentation] Selective Detection of Cellular Signaling Molecules. (2010)
  • Author(s): Takashi Morii
  • Organizer: 1st Asian Chemical Biology Conference
  • Place of Presentation: Seoul(韓国)(招待講演)
  • Year and Date: 2010-06-27
• [Book] Recent progress in the construction methodology of fluorescent biosensors based on biomolecules, "Biosensors, Emerging Materials and Applications" (2011)
  • Author(s): Eiji Nakata, FongFong Liew, Shun Nakano, Takashi Morii
  • Total Pages: 18
  • Publisher: Intech
• [Book] Recent progress in the construction methodology of fluorescent biosensors based on biomolecules.(Biosensors for Health, Environment and Biosecurity) (2011)
  • Author(s): Nakata, E., Liew, F.-F., Nakano, S., Morii, T.
  • Total Pages: 18
  • Publisher: In Tech
• [Remarks]
  • URL: http://www.iae.kyoto-u.ac.jp/english/soshiki/biofunctional.html
• [Remarks]
  • URL: http://www.iae.kyoto-u.ac.jp/english/soshiki/biofunctional.html