神経シナプスにおける接着複合体の準安定な二次元クラスター形成

• Project Area: Integrative understanding of biological processes mediated by transient macromolecular complexes; New technology for visualizing physiologically metastable states.
• Project/Area Number: 22121513
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 高木 淳一 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (90212000)
• Project Period (FY): 2010 – 2011
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2011)
• Budget Amount: ¥11,180,000 (Direct Cost: ¥8,600,000、Indirect Cost: ¥2,580,000); Fiscal Year 2011: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000); Fiscal Year 2010: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
• Keywords: 過渡的複合体 / シナプス / ニューレキシン / ニューロリギン / X線結晶構造解析 / 電子顕微鏡イメージング / クライオ電子顕微鏡

Research Abstract

神経シナプスは安定な構造ではなく、多くの膜蛋白質と会合分子がダイナミックに入れ替わり、常に変化する存在である。本研究は、「シナプス間を連結する接着分子複合体が、きわめて弱い相互作用によってラテラルに集合離散することが、シナプスのダイナミックな構造と機能を結びつける鍵である」という仮説について、この準安定複合体の可視化と解析を通して検証するものである。具体的には、シナプス前膜に発現するニューレキシン(Nrx)と、シナプス後膜に発現するニューロリギン(NL)を対象に、膜上に存在するNrxやNLによって過渡的複合体が形成する様子をX線結晶構造解析、電子顕微鏡イメージング、および光学顕微鏡といったマルチな手法で観察した。昨年度までに、蛍光-電子線相関顕微観察法(Correlation Light-Electron Microscopy; CLEM)によってNLとNrx1βの作る細胞間接着構造をイメージングに成功していたが、今年度はまず、Nrx1βと異なりN末端に大きなエキストラ領域を含むNrxhの構造を、部分断片を用いたX線結晶構造解析によって解明し、報告した。また、細胞間接着構造がNrx1β-NL間に形成される密で規則的な二次元構造体に依存することを証明するため、相互作用を阻害する変異体をデザインし、それらを発現する細胞株もすべて樹立して、接着部位のイメージングを行った。その結果は規則的な二次構造の重要性を支持するものであった。現在これらすべてをまとめた論文を投稿中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は、精製蛋白質を用いたX線結晶構造解析から、細胞を用いた光学および電子顕微鏡イメージングまで多岐にわたる手法を駆使するため、一つ一つ予想外の時間がかかる。そのため、研究自体は当初の計画より若干遅れ気味に進行している。しかしながら、単なる受容体の構造解析という次元を超えて、神経シナプスの構築原理、さらには細胞接着構造のin situイメージングという極めて根源的な科学的新知見に結びつく研究になりつつある点で予想以上の成果をあげつつある。よって総合的に見て、「おおむね順調に進展した」と判断する。

Strategy for Future Research Activity

本研究課題の内容は現在Cell Reports誌においてリバイス段階に来ており、レフェリーの好意的なコメントと、疑問に答えうる追加実験に成功していることから、今年度前半にはpublishできるものと考える。また、本研究課題の成果に触発されたあらたな研究テーマも開始しており、2年間の研究で十分な波及効果が上げられたとかんがえている。

Research Products

• [Journal Article] Neutralizationof theγ-secretase activity bymonoclonal antibody againstextracellular domain of nicastrin (2012)
  • Author(s): Hayashi I, Takatori S, Urano Y, Miyake Y, Takagi J, Sakata-Yanagimoto M, Iwanari H, Osawa S, Morohashi Y, Li T, Wong PC, Chiba S, Kodama T, Hamakubo T, Tomita T, Iwatsubo T
  • Journal Title: Oncogene Volume: 31 Issue: 6 Pages: 787-79
  • DOI: 10.1038/onc.2011.265
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystal structure of α5β1 integrin ectodomain : Atomic details of the fibronectin receptor (2012)
  • Author(s): Nagae, M., et al.
  • Journal Title: The Journal of Cell Biology Volume: 197 Issue: 1 Pages: 131-140
  • DOI: 10.1083/jcb.201111077
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural Basis for Variant-Specific Neuroligin-Binding by α-Neurexin (2011)
  • Author(s): Tanaka, H., et al.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 6 Issue: 4 Pages: e19411-e19411
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0019411
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Functional importance of covalent homodimer of reelin linked via its central region (2011)
  • Author(s): Yasui, N., et al.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. Volume: 286 Issue: 40 Pages: 35247-35256
  • DOI: 10.1074/jbc.m111.242719
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystallization and preliminary crystallographic anal-ysis of human LR11 Vps10p domain (2011)
  • Author(s): Nakata Z, Nagae M, Yasui N, Bujo H, Nogi T, Takagi J
  • Journal Title: Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun Volume: 67 Issue: 1 Pages: 129-132
  • DOI: 10.1107/s1744309110048153
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural basis for specific recognition of reelin by its receptors. (2010)
  • Author(s): Yasui N, Nogi T, Takagi J.
  • Journal Title: Structure Volume: 18 Pages: 320-331
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Detection of endogenous LRP6 expressed on human cells by monoclonal antibodies specific for the native conformation. (2010)
  • Author(s): Yasui N, Takagi J., et al.
  • Journal Title: J.Immunol.Methods Volume: 352 Pages: 153-160
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Laminin-121-Recombinant expression and interactions with integrins. (2010)
  • Author(s): Sasaki, T., Takagi J., et al.
  • Journal Title: Matrix Biology Volume: 29 Pages: 484-493
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Comparison of the envelope architecture of E.coli using two methods : CEMOVIS and cryo-electron tomography. (2010)
  • Author(s): Kishimoto-Okada, A., Takagi J., et al.
  • Journal Title: J.Electron Microsc. Volume: 59 Pages: 419-493426
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural basis for semaphorin signaling through the plexin receptor. (2010)
  • Author(s): Nogi, T., Takagi J., et al.
  • Journal Title: Nature Volume: 467 Pages: 1123-1127
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Crystallization and preliminary crystallographic analysis of human LR11 Vps10p domain. (2010)
  • Author(s): Nakata, Z., Takagi J., et al.
  • Journal Title: Acta Crystallographica.F Volume: 67 Pages: 129-132
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Tomosyn Inhibits Synaptotagmin-1-mediated Step of Ca2+-dependent Neurotransmitter Release through Its N-terminal WD40 Repeats. (2010)
  • Author(s): Yamamoto, Y.Iwasaki, K., et al
  • Journal Title: J Biol Chem Volume: 285 Pages: 40943-40955
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Cutinaseタグを用いた生細胞上での分子間相互作用解析 (2012)
  • Author(s): 松永幸子, 他
  • Organizer: 日本薬学会第132年会
  • Place of Presentation: 北海道大学
  • Year and Date: 2012-03-30
• [Presentation] Structural basis for peptide ligand recognition by LR11/sorLA Vps10p domain (2012)
  • Author(s): Takagi, Junichi
  • Organizer: Keystone Symposia "ApoE, Alzheimer's and Lipoprotein Biology"
  • Place of Presentation: Keystone Resort, CO, USA(招待講演)
  • Year and Date: 2012-02-28
• [Presentation] ソーティング受容体LR11の持つ"弱くて特異性の低い"相互作用の秘密 (2011)
  • Author(s): 高木、淳一
  • Organizer: 第2回「神経科学と構造生物学の融合」セミナー
  • Place of Presentation: 岡崎コンファレンスセンター(招待講演)
  • Year and Date: 2011-11-21
• [Presentation] Structural basis for semaphorin signaling through the plexin receptor (2011)
  • Author(s): Takagi, Junichi
  • Organizer: The 9th Taiwan-JapanJoint Seminar on Crystallography
  • Place of Presentation: Taiwan National University, Taiwan(招待講演)
  • Year and Date: 2011-11-07
• [Presentation] フィブロネクチン受容体(インテグリンα5β1)の立体構造 (2011)
  • Author(s): 高木、淳一
  • Organizer: 第84回日本生化学会大会シンポジウム"蛋白質の高分解能構造と細胞機能発現のメカニズム"
  • Place of Presentation: 京都国際会議場(招待講演)
  • Year and Date: 2011-09-22
• [Presentation] Structures of β1 and β4 integrins determined by electron microsocpy (2011)
  • Author(s): Miyazaki, N., et al.
  • Organizer: 第7回ASO International Meeting
  • Place of Presentation: ホテルグリーンピア南阿蘇
  • Year and Date: 2011-07-30
• [Presentation] In situ visualization and dynamics of internalized membrane proteins (2011)
  • Author(s): 松永幸子, 他
  • Organizer: 第7回ASO International Meeting
  • Place of Presentation: ホテルグリーンピア南阿蘇
  • Year and Date: 2011-07-30
• [Presentation] 神経シナプスにおける接着複合体の準安定な二次元クラスター形成 (2011)
  • Author(s): 高木、淳一
  • Organizer: 新学術領域「過渡的複合体」公開シンポジウム
  • Place of Presentation: 東京大学薬学部(招待講演)
  • Year and Date: 2011-07-21
• [Presentation] α5β1インテグリンの結晶構造とそのリガンド結合機構 (2011)
  • Author(s): 長江雅倫, 他
  • Organizer: 第11回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: ホテル阪急エキスポパーク
  • Year and Date: 2011-06-08
• [Presentation] Cutinase融合タンパク質を用いた分子標識と生細胞イメージング:Dkk1-LRP6相互作用ドメインの同定 (2011)
  • Author(s): 松永幸子, 他
  • Organizer: 第11回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: ホテル阪急エキスポパーク
  • Year and Date: 2011-06-08
• [Presentation] 神経シナプス接着複合体のマルチモード構造解析 (2011)
  • Author(s): 高木、淳一
  • Organizer: 日本蛋白質科学会第11回年会シンポジウム「生命機能を原子分子レベルで探る-細胞システムレベルでの蛋白質科学をめざして-」
  • Place of Presentation: ホテル阪急エキスポパーク(招待講演)
  • Year and Date: 2011-06-07
• [Presentation] 多様なアイソフォームを持つ接着蛋白質ニューレキシン・ニューロリギンの相互作用メカニズム (2011)
  • Author(s): 田中宏樹, 他
  • Organizer: 第11回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: ホテル阪急エキスポパーク
  • Year and Date: 2011-06-07
• [Presentation] Structural basis for semaphorin signaling through the plexin receptor (2011)
  • Author(s): Takagi, Junichi
  • Organizer: Research Seminar at IRCC
  • Place of Presentation: Torino, Italy(招待講演)
  • Year and Date: 2011-05-06
• [Presentation] Structural analyses of b1 integrins by means of electron microscopy and X-ray crystallography (2011)
  • Author(s): Takagi, Junichi
  • Organizer: Gordon Research Conference (Fibronectin, Integrins & Related Molecules)
  • Place of Presentation: Ill Ciocco, Italy(招待講演)
  • Year and Date: 2011-05-01
• [Presentation] セマフォリンシグナルを伝達するプレキシン受容体活性化の構造的基盤 (2011)
  • Author(s): 高木淳一
  • Organizer: 平成23年度細胞外環境シンポジウム
  • Place of Presentation: 京都大学芝蘭会館(招待講演)
  • Year and Date: 2011-02-16
• [Presentation] 脳の層構造形成を制御するリーリンシグナルの分子機構 (2011)
  • Author(s): 禾晃和、高木淳一, 他
  • Organizer: 蛋白質研究所セミナー・細胞表面受容体と細胞内輸送
  • Place of Presentation: 大阪大学蛋白質研究所(招待講演)
  • Year and Date: 2011-01-12
• [Presentation] Structural basis for peptide ligand recognition by LR11 Vps10p domain (2011)
  • Author(s): 北郷悠, 他
  • Organizer: PDB40 symposium
  • Place of Presentation: Cold Spring Harbor Laboratory, USA
• [Presentation] LR11 Vps10pドメインのリガンド認識機構 (2011)
  • Author(s): 北郷悠, 他
  • Organizer: 2011年度日本結晶学会年会
  • Place of Presentation: 北海道大学学術交流会館
• [Presentation] リーリンN末端断片の精製及び結晶化 (2011)
  • Author(s): 長江雅倫, 他
  • Organizer: 2011年度日本結晶学会年会
  • Place of Presentation: 北海道大学学術交流会館
• [Presentation] Structural basis for semaphorin signaling through the plexin receptor. (2010)
  • Author(s): Takagi, Junichi
  • Organizer: International GCOE Symposium
  • Place of Presentation: Hyogo, Japan(招待講演)
  • Year and Date: 2010-11-09
• [Presentation] Combination of Correlative Light-Electron Microscopy and X-ray Crystal lography Revealed a Unique Trans-Synaptic Adhesion Architecture. (2010)
  • Author(s): Takagi, Junichi
  • Organizer: The 2010 Asian Crystallographic Association Conference (AsCA2010)
  • Place of Presentation: Busan,(韓国)(招待講演)
  • Year and Date: 2010-11-02
• [Presentation] Tags for easy detection, purification, and soluble expression of mammalian extracellular proteins (2010)
  • Author(s): Takagi, Junichi
  • Organizer: The Bioprocessing Summit, "Affinity Tag Protein Purification"
  • Place of Presentation: Boston Marriott Long Wharf, Boston,(米国)(招待講演)
  • Year and Date: 2010-08-24
• [Presentation] Structural and functional analysis of LR11 Vps10p domain (2010)
  • Author(s): Nakata, Z., Takagi, J., et al
  • Organizer: American Crystallographic Association
  • Place of Presentation: Sheraton Chicago Hotel & Towers(米国)
  • Year and Date: 2010-07-25
• [Presentation] Ligand binding mechanism of lipoprotein receptor family proteins revealed by three-dimensional structure analyses. (2010)
  • Author(s): Takagi, Junichi
  • Organizer: Gordon Research Conference (Lipoprotein metabolism)
  • Place of Presentation: Waterville Valley,(米国)(招待講演)
  • Year and Date: 2010-06-23
• [Presentation] 大腸菌での可溶性発現と簡便な精製を可能にするFATTタグ (2010)
  • Author(s): 田畑早苗、高木淳一, 他
  • Organizer: 第10回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター
  • Year and Date: 2010-06-18
• [Presentation] 光-電子相関顕微鏡観察(CLEM)を用いた細胞間超分子構造の解明 (2010)
  • Author(s): 田中宏樹、高木淳一, 他
  • Organizer: 第10回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター
  • Year and Date: 2010-06-18
• [Presentation] 抗原ペプチド結合前後のモノクローナル抗体P20.1の立体構造 (2010)
  • Author(s): 寒川剛、高木淳一, 他
  • Organizer: 第10回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター
  • Year and Date: 2010-06-17
• [Presentation] Single molecule studies on structure and function of photoactivated adenylyl cyclase (PAC), a sensor for photomovement in Euglena (2010)
  • Author(s): 岩崎憲治、高木淳一, 他
  • Organizer: Gordon Research Conference, Photosensory Receptors & Signal Transduction
  • Place of Presentation: Lucca(Barga),(イタリア)(招待講演)
• [Presentation] 神経シナプス接着機構の解明-原子から細胞まで- (2010)
  • Author(s): 岩崎憲治、高木淳一, 他
  • Organizer: 日本顕微鏡学会第66回学術講演会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場(招待講演)
• [Presentation] Utilization of acovalent probe and genetically-coded probe-acceptor in a dual-purpose labeling system for light and electron microscopy (2010)
  • Author(s): Matsunaga, Y., Takagi, J., et al
  • Organizer: 17th International Microscopy Congress
  • Place of Presentation: Windsor Barra Convention Center, Rio de Janeiro,(ブラジル)
• [Presentation] 遺伝子導入型プローブによる分子標識 (2010)
  • Author(s): 松永幸子、高木淳一, 他
  • Organizer: 日本顕微鏡学会第66回学術講演会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場
• [Presentation] Cutinase融合タンパク質を用いた部位特異的、共有結合的、一段階分子標識法の開発 (2010)
  • Author(s): 松永幸子、高木淳一, 他
  • Organizer: 第10回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター
• [Book] タンパク質実験ノート(下)(岡田雅人、三木裕明、宮崎香編) (2011)
  • Author(s): 寒川剛、高木淳一
  • Total Pages: 221
  • Publisher: 羊土社