Publicly Offered Research
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
ミクロオートファジーはリソソーム膜が直接細胞質成分を取り込む機構を指す。酵母においてはペルオキシソーム、脂肪滴、核などがミクロオートファジーを介して分解されることが報告されているが、哺乳動物におけるミクロオートファジーの知見は限られている。本研究では、ミクロオートファジー機構においてリソソームが細胞内の膜構造を認識して分解する分子機構、及びその生物学的意義を明らかにすることを目指す。
ミクロオートファジーはリソソーム膜が直接細胞質成分を取り込む機構を指す。酵母においてはペルオキシソーム、脂肪滴、核などがミクロオートファジーを介して分解されることが報告されているが、哺乳動物におけるミクロオートファジーの知見は限られている。これまでに、我々は細胞内物質輸送による自然免疫応答分子STINGの活性制御機構を明らかにしてきたが、その解析の中で、STINGがミクロオー トファジーによって分解されることを示唆する予備結果を得た。興味深いことに、この過程はリサイクリングエンドソーム由来の小胞の集まり をリソソームが直接貪食する機構であった。本研究ではSTINGをミクロオートファジーのモデル基質として利用し、遺伝学的スクリーニング、 超解像ライブセルイメージング、プロテオミクス解析を駆使することで、リソソームが細胞内の膜構造を認識して分解する分子機構、及びその 生物学的意義を明らかにすることを目指す。今年度はGFP-STINGの刺激依存的な分解を指標にしたsiRNAスクリーニングにより、ミクロオートファジーに必要な遺伝子を同定した。 超解像ライブイメージング、及び電子顕微鏡解析を用いて、STINGがリソソームによって包み込まれる瞬間、及び分解される過程の可視化を試みた。その結果、超解像顕微鏡解析によりリソソームとSTINGの動態を生細胞内で可視化し、STING陽性の膜構造がリソソーム に包み込まれる瞬間を捉えた。
1: Research has progressed more than it was originally planned.
今年度はGFP-STINGの刺激依存的な分解を指標にしたsiRNAスクリーニングにより、ミクロオートファジーに必要な遺伝子としてESCRT複合体遺伝子、Tsg101およびVps4を同定した。Tsg101およびVps4を発現抑制した細胞では、刺激後ゴルジ体を通過した後のSTINGがリソソームに取り込まれず、細胞質中に蓄積していることを見出した。さらに、Tsg101の発現抑制およびレスキュー実験から、Tsg101のユビキチン認識ドメインがSTINGのミクロオートファジー分解に必要であることを見出した。また、興味深いことに、STING陽性の膜構造がリソソームに取り込まれる際に、リサイクリングエンドソームタンパク質であるトランスフェリン受容体やRab11の一部がリソソームに取り込まれていることを見出した。この結果から、リソソームによるミクロオートファジーはオルガネラ膜構造を分解する能力を有すると考えられた (Kuchitsu et al., Nat Cell Bilo 2023)。以上の結果は哺乳動物におけるミクロオートファジーに関して新しい知見をもたらすものでることから、当初の計画以上に進展していると判断した。
現在STINGのミクロオートファジー分解の分子機構として、STINGのユビキチン化がミクロオートファジーに必要である可能性を見出している。そこで次年度以降は、ユビキチン化修飾に着目してミクロオートファジーの分子機構を明らかにする。具体的には、STINGのユビキチン鎖の結合様式の同定、およびおE3リガーゼの同定を目指す。E3リガーゼに関しては、ハイスループットスクリーニングを行うためにSTINGの分解量を指標にしたマルチウェルプレートベースのアッセイ系の構築を進めている。
All 2023 2022
All Journal Article (2 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results, Peer Reviewed: 1 results, Open Access: 1 results) Presentation (3 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results)
Nature Cell Biology
Volume: 25 Issue: 3 Pages: 453-466
10.1038/s41556-023-01098-9
JSIAD Journal
Volume: 1 Issue: 1 Pages: 24-34
10.34563/jsiadjournal.1.1_24
130008142173
