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インスリン分泌顆粒分解の空間的・時間的評価と分子機構および病態生理学的意義の検討

Publicly Offered Research

Project AreaMultimode autophagy: Diverse pathways and selectivity
Project/Area Number 22H04655
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)

Allocation TypeSingle-year Grants
Review Section Biological Sciences
Research InstitutionJuntendo University

Principal Investigator

西田 友哉  順天堂大学, 医学部, 准教授 (10581449)

Project Period (FY) 2022-04-01 – 2024-03-31
Project Status Completed (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help
¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Keywordsインスリン / オートファジー / ミクロオートファジー / 超解像顕微鏡 / 膵β細胞 / インスリン分泌顆粒 / クリノファジー / 蛍光レポーター / ゲノムワイドスクリーニング / CRISPR/Cas9 / 糖尿病
Outline of Research at the Start

膵β細胞内でのインスリン分泌顆粒( Insulin Secretory Granules; ISG)分解の分子機構については未解明であった。我々はそのモニターを可能とする蛍光レポーターを開発した。さらに、CRISPR/Cas9システムと組み合わせ、ゲノムワイドスクリーニングの基礎を確立した。本研究ではISG分解を制御する因子を同定し、個々の因子の機能及び相互作用解析を経て、分解機構の全体像を解明する。さらに、生体内でもISG 分解の評価が可能なモニターマウスを作成してISG分解の評価を行い、同定した制御因子のノックアウトマウスの解析を併せて実施し、ISG分解の持つ病態生理学的意義を解明する。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、インスリン分泌顆粒( Insulin Secretory Granules; ISG)の膵β細胞内分解機構を解明しその病態生理学的意義を明らかにすることを目指した。
はじめに、アミノ酸・グルコース飢餓刺激によって誘導されるISG分解を評価する蛍光レポーターを作製した。CRISPR/Cas9システムによりオートファジー関連遺伝子のノックアウト細胞を作製し、主要なマクロオートファジー制御機構がISG分解に関与しないことを示した。さらに、ゲノムワイドgRNAを用いた遺伝子スクリーニングを実施し、同定された遺伝子群にはマクロオートファジーの制御経路が含まれないことが明らかとなった。
これらの結果を論文として発表する一方(Kanai A. et al. BBRC, 2023)、さらに解析を進めるべく2つの検討を行った。ひとつは、超解像顕微鏡を用いたISG分解のリアルタイム観察であり、ZEISS社製のライトシート顕微鏡を用いてISG下流およびリソソームの挙動を長時間観察することに成功した。もうひとつは、飢餓刺激ではない定常状態のISG分解の評価系の作製である。具体的には、インスリン分子に酸性化環境に耐性の蛍光タンパクであるVenusを結合させたInsulin-Venusを、Tet-Onシステムで発現させる膵β細胞株を作製した。この細胞では、Tet-OnからOffにすることで、ISG分解が誘導されてVenusによる蛍光が消失すること、その消失がリソソームプロテアーゼ阻害薬により阻害されることを示した。
今後は、これらのツールを用いて定常的なISG分解の制御機構に関する検討へと研究を展開させることを企図している。

Research Progress Status

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

Report

(2 results)
  • 2023 Annual Research Report
  • 2022 Annual Research Report
  • Research Products

    (7 results)

All 2023 2022

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (4 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Invited: 1 results)

  • [Journal Article] Genome-wide screening for regulators of degradation of insulin secretory granules with a fluorescent reporter.2023

    • Author(s)
      Kanai A, Nishida Y, Iwamoto T, Yokota M, Aoyama S, Ueki K, Ito M, Uzawa H, Iida H, Koike M, Watada H.
    • Journal Title

      Biochem Biophys Res Commun.

      Volume: 676 Pages: 132-140

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2023.07.040

    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Monitoring autophagic flux in vivo revealed its physiological response and significance of heterogeneity in pancreatic beta cells2023

    • Author(s)
      Aoyama Shuhei、Nishida Yuya、Uzawa Hirotsugu、Himuro Miwa、Kanai Akiko、Ueki Kyosei、Ito Minami、Iida Hitoshi、Tanida Isei、Miyatsuka Takeshi、Fujitani Yoshio、Matsumoto Masaki、Watada Hirotaka
    • Journal Title

      Cell Chemical Biology

      Volume: - Issue: 6 Pages: 658-671.e4

    • DOI

      10.1016/j.chembiol.2023.03.001

    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 膵β細胞におけるオートファジーの多様性とその理解2023

    • Author(s)
      西田友哉、青山周平、金井晶子、岩本達也、伊藤南、植木響政、小池正人、綿田裕孝
    • Journal Title

      日本体質医学会雑誌

      Volume: 85

    • Related Report
      2022 Annual Research Report
  • [Presentation] Genome-wide Screening for Regulators of Degradation of Insulin Secretory Granules with a Fluorescent Reporter2023

    • Author(s)
      Akiko Kanai, Yuya Nishida, Tatsuya Iwamoto, Mutsumi Yokota, Shuhei Aoyama, Kyosei Ueki, Minami Ito, Hirotsugu Uzawa, Hitoshi Iida, Masato Koike, Hirotaka Watada
    • Organizer
      European Association for the Study of Diabetes
    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Identification of Molecular Mechanism of Degradation of Insulin Secretory Granules(ISG) by Genome-wide Screening2022

    • Author(s)
      Akiko Kanai、Yuya Nishida、Shuhei Aoyama、Hirotsugu Uzawa、Tatsuya Iwamoto、Minami Ito、Kyosei Ueki、Masato Koike、Hirotaka Watada
    • Organizer
      The 10th International Symposium on Autophagy(ISA2022)
    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Analysis of the Role of Cathepsin D in Maintaining Pancreatic β cell Homeostasis2022

    • Author(s)
      Kyosei Ueki、Yuya Nishida、Shuhei Aoyama、Hirotsugu Uzawa、Minami Ito、Akiko Kanai、Tatsuya Iwamoto、Hirotaka Watada
    • Organizer
      The 10th International Symposium on Autophagy(ISA2022)
    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 膵β細胞におけるオートファジーの多様性とその理解2022

    • Author(s)
      西田友哉、青山周平、金井晶子、岩本達也、伊藤南、植木響政、小池正人、綿田裕孝
    • Organizer
      第72回 日本体質医学会 シンポジウム
    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Invited

URL: 

Published: 2022-04-19   Modified: 2024-12-25  

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