Elucidation of the mechanism by which zygotes recovers from abnormal chromosome segregation to maintain totipotency

Publicly Offered Research

Project Area	Program of totipotency: From decoding to designing
Project/Area Number	22H04674
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
Allocation Type	Single-year Grants
Review Section	Biological Sciences
Research Institution	Kobe University
Principal Investigator	京極博久神戸大学, 農学研究科, 助教 (20726038)
Project Period (FY)	2022-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥8,580,000 (Direct Cost: ¥6,600,000、Indirect Cost: ¥1,980,000) Fiscal Year 2023: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000) Fiscal Year 2022: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Keywords	全能性 / 受精卵 / 初期胚 / 染色体分配異常 / 片親性ダイソミー
Outline of Research at the Start	全能性を持つ受精卵は，卵子と精子が接合（受精）することで生じる初期発生におけるスタートの細胞である。しかしながら，卵子は減数分裂過程で染色体分配異常を起こしやすく染色体数異常を持った卵子が多いことはよく知られており，これは，受精後の全能性獲得において大きなリスクである。そこで，受精卵が初期発生の過程で染色体分配異常から回復する何らかのメカニズムがあるのではないかという仮説を立て，その仮説を証明することを目的とする。この仮説を証明することにより，受精卵が全能性を維持するために染色体分配異常から回復するメカニズムを持つという説を提唱できる。
Outline of Annual Research Achievements	全能性を持つ受精卵は，卵子と精子が接合（受精）することで生じる初期発生におけるスタートの細胞である。しかしながら，卵子は減数分裂過程で染色体分配異常を起こしやすく染色体数異常を持った卵子が多いことはよく知られており，これは，受精後の全能性獲得において大きなリスクである。そこで，申請者は受精卵が初期発生の過程で染色体分配異常から回復する何らかのメカニズムがあるのではないかと考え実験を計画した。まず，受精卵および２細胞期胚の正確な染色体分配異常頻度の解析を行った。具体的には，受精卵および２細胞期胚を用いて，シングルセル(割球)によるDNAのコピー数解析（scRepli-seq）を行った。遺伝的に離れた2系統，C57BL/6とMSM/Msマウスの精子と卵子を用いて受精卵を作成し実験に用いた。さらに顕微操作により，雌雄の前核を抜き出し、scRepli-seq を行うことで系統による影響も確認した。NGSデータの解析により，受精卵の約10％が卵子由来の染色体分配異常を持っていること，一方で，２細胞期胚では，染色体分配異常のほとんどが片方の割球にのみ見られ，もう一方の割球は正常になっていることが明らかとなった。回復メカニズムとして余剰になった染色体が微小核を形成し、第一卵割時に紡錘体外にあることで異常から回復している様子がライブセルイメージングにより観察された。これらの結果は，2細胞期胚では割球のペアで染色体の状態が異なっており，２細胞期になる際に，片方の割球に異常を集めることで，もう一方の割球は正常な染色体を持ち全能性を維持するメカニズムの存在を示唆している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 基盤となる染色体分配異常頻度と異常からの回復を示唆するデータに関しては，順調に取得できた。まだ、データは少ないが、微小核による異常から回復の様子も観察した。
Strategy for Future Research Activity	データから片親性ダイソミーが起こっている可能性が示唆されたが、どのようにして雌雄の前核がお互いの染色体数を認識しているのかは、仮説が少なく検討が困難な可能性がある。受精卵の紡錘体はDual spindleと呼ばれる雌雄２つの紡錘体を雌雄前核が並んでいた軸に対して垂直方向に形成し融合するという受精卵特有の紡錘体形成システムがある（Reichmann et al., Science. 2018; Schneider et al., JCB. 2021）。しかし，これらの生物学的意味は未だに分かっておらず，アクチン阻害剤（Cytochalasin B）によって形成する軸を，キネシン阻害剤（Monastrol）と微小管阻害剤（Nocodazole）によってDual spindleの形成を阻害することが可能であるが発生には影響しないと言われている。そこで，これらの受精卵特異的な紡錘体形成メカニズムが異常な染色体を認識するための機能のひとつと考え，阻害剤によりDual spindleの形成軸や形成そのものを阻害し，ライブセルイメージングおよびscRepli-seqによる詳細な染色体分配異常の解析を行うことで，これらのメカニズムを解明する足掛かりとする。異常のある受精卵や異常から回復した2細胞期胚の割球がminor ZGAやMajor ZGAを正しく起こし全能性を獲得しているのかをNGSベースの手法で解析する。