高速分子動画でTRPチャネルの温度センサー部位を見極める

• Project Area: Non-equilibrium-state molecular movies and their applications
• Project/Area Number: 22H04753
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: Tottori University
• Principal Investigator: 日野 智也 鳥取大学, 工学研究科, 准教授 (40373360)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥6,630,000 (Direct Cost: ¥5,100,000、Indirect Cost: ¥1,530,000); Fiscal Year 2023: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000); Fiscal Year 2022: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
• Keywords: イオンチャネル / TRPチャネル / 膜タンパク質 / 構造生物学 / 結晶構造解析 / クライオ電子顕微鏡 / X線結晶構造解析 / 赤外分光 / 温度感受性タンパク質

Outline of Research at the Start

本研究では閉状態から中間状態を経て開状態に至る構造変化をシリアルフェムト秒X線結晶構造解析により動画化し、各過程におけるTRPV3チャネルの温度センサー部位を同定する。また、結晶中で捉えられた構造変化が我々の体内で起こる生理現象を記述する情報として適切かどうかを、赤外分光法により生理的環境下での構造変化と比較することで慎重に検証する。さらに、温度感知域の異なるTRPV4チャネルについても同様の解析を行うことにより、TRPチャネルにおける温度感知機構の共通性や多様性を見出す。

Outline of Annual Research Achievements

TRPチャネルは、脊椎動物において環境温度の感知機能を担う陽イオン選択的イオンチャネルである。これまでに、クライオ電子顕微鏡（Cryo-EM）単粒子解析やX線結晶構造解析により、多くの温度応答型TRPチャネルの立体構造が解明されてきた。しかし、熱感知機構において最も重要な温度センサー部位についてはほとんど情報が得られていない。申請者はTRPチャネルの構造生物学研究に継続的に取り組み、ヒト由来TRPV3とTRPV4の結晶化及びCryo-EMによる高分解能マップの取得に成功した。そこで本研究では「温度」と同様な物理刺激である光を受容するタンパク質の構造変化を高い時空間分解能で動画化することが可能なシリアルフェムト秒X線結晶構造解析（SFX）法に温度ジャンプ法を組み合せ、熱刺激直後に起こる構造変化を検出することによりTRPチャネルの温度センサー部位の同定を目指す。
昨年度構築したプレートスキャンシステムによる微結晶品質評価系を用い、様々なスクリーニングキットにより得られた沈殿物にX線を照射することで、新たな結晶化条件を複数見出すことができた。これらは顕微鏡下では結晶であることが判別できなかったので、本システムの有用性が確認できた。これらの結晶化条件について条件展開を実施することで単結晶を作成し、X線回折実験を行ったところ、これまでに得られていた最高分解能を大幅に上回る9.2Åの回折斑点を確認することができた。現状の品質では構造決定には至らないが、同システムを用いて脱水などの条件検討をさらに行うことでより一層の高品質が期待できる。
一方、クライオ電子顕微鏡単粒子解析により、TRPV3とTRPV4についてそれぞれ2.5Åと2.9Åの密度マップを得ることができた。TRPV3については分子モデルを作成し、温度応答機構に関与する領域の構造多型を検出した。

Research Progress Status

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Mapping protein dynamics at high spatial resolution with temperature-jump X-ray crystallography (2023)
  • Author(s): Wolff, A. M., Nango, E., Young, I. D., Brewster, A. S., Kubo, M., Nomura, T., Sugahara, M., Owada, S., Barad, B. A., Ito, K., Bhowmick, A., Carbajo, S., Hino, T., Holton, J. M., Im, D., O'Riordan, L. J., Tanaka, T., Tanaka, R., Sierra, R. G., Yumoto, F., Tono, K., Iwata, S., et al
  • Journal Title: Nat. Chem. Volume: 15(11) Issue: 11 Pages: 1549-1558
  • DOI: 10.1038/s41557-023-01329-4
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Anammox Bacterial S-Adenosyl-l-Methionine Dependent Methyltransferase Crystal Structure and Its Interaction with Acyl Carrier Proteins (2023)
  • Author(s): Uegaki Tesshin, Takei Taisei, Yamaguchi Shuhei, Fujiyama Keisuke, Sato Yusuke, Hino Tomoya, Nagano Shingo
  • Journal Title: International Journal of Molecular Sciences Volume: 24 Issue: 1 Pages: 744-744
  • DOI: 10.3390/ijms24010744
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Structural Basis for the Prenylation Reaction of Carbazole‐Containing Natural Products Catalyzed by Squalene Synthase‐Like Enzymes (2022)
  • Author(s): Nagata Ryuhei、Suemune Hironori、Kobayashi Masaya、Shinada Tetsuro、Shin‐ya Kazuo、Nishiyama Makoto、Hino Tomoya、Sato Yusuke、Kuzuyama Tomohisa、Nagano Shingo
  • Journal Title: Angewandte Chemie Volume: 134 Issue: 20
  • DOI: 10.1002/ange.202117430
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural insights into the G protein selectivity revealed by the human EP3-Gi signaling complex (2022)
  • Author(s): Ryoji Suno, Yukihiko Sugita, Kazushi Morimoto, Hiroko Takazaki, Hirokazu Tsujimoto, Mika Hirose, Chiyo Suno-Ikeda, Norimichi Nomura, Tomoya Hino, Asuka Inoue, Kenji Iwasaki, Takayuki Kato, So Iwata, Takuya Kobayashi
  • Journal Title: Cell Rep. Volume: 40(11) Issue: 11 Pages: 111323-111323
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2022.111323
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] Diels-Alder反応を行う酵素などの反応過程可視化に向けた微結晶化 (2023)
  • Author(s): 〇長谷川颯人、日野智也、佐藤裕介、永野真吾
  • Organizer: 令和5年度 新学術領域研究「高速分子動画」シンポジウム
• [Presentation] プレートスキャンシステムを用いた微結晶品質評価 (2023)
  • Author(s): 〇日野智也、遠藤鴻志郎、永野真吾
  • Organizer: 令和5年度 新学術領域研究「高速分子動画」シンポジウム
• [Presentation] プロテアソームシャトル因子RAD23BによるK48結合型 ユビキチン鎖特異的認識機構の構造基盤 (2023)
  • Author(s): 〇金澤豪、瓜島絢、角田海斗、日野智也、永野真吾、佐藤裕介
  • Organizer: 第23回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] 「ヒトと分裂酵母由来のUPS関連酵素UCH37-RPN13によるユビキチン鎖切断活性の比較」「Comparison of ubiquitin chain cleavage specificity by UPS-related enzyme UCH37-RPN13 from human and fission yeast.」 (2023)
  • Author(s): 〇徳久歩乃佳、吉岡直亮、日野智也、永野真吾、佐藤裕介
  • Organizer: 第23回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] 人工抗体モノボディによる低分子化合物認識機構の解明 (2023)
  • Author(s): 〇遠藤鴻志郎、梅本駿、都築成晃、吉井達之、築地真也、佐藤裕介、村上裕、永野真吾、日野智也
  • Organizer: 第23回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] トマトの苦味物質トマチンを酸化的に代謝する酵素群の基質認識メカニズムの解明と改変 (2023)
  • Author(s): 〇吉岡剛汰, 宮崎麻紗美, 秋山遼太, 水谷正治, 野川俊彦, 越野広雪, 佐藤裕介, 日野智也, 永野真吾
  • Organizer: 第23回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] 高活性ブラシノステロイドの生合成に関与する酵素CYP85A3のX線結晶構造解析 (2023)
  • Author(s): 〇児島よしの、眞鍋菜緒子、藤山敬介、大西利幸、水谷正治、佐藤裕介、日野智也、永野真吾
  • Organizer: 第23回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] 複雑な梯子状疎水基を生産するアナモックス菌のアシルキャリアプロテインとSAM依存性メチル基転移酵素の相互作用に関する構造生物学に基づいた考察 (2023)
  • Author(s): 〇上垣哲心、竹井大誉、山口修平、藤山啓介、佐藤祐介、日野智也、永野真吾
  • Organizer: 第23回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] FAF1 およびUBXD7 のp97 活性化ドメインの同定 (2023)
  • Author(s): 〇佐藤裕介、安本菜那子、日野智也、永野 真吾
  • Organizer: 第23回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] Functional modification of 2-oxoglutarate dependent dioxygenases that oxidatively metabolize tomatine (2023)
  • Author(s): 〇吉岡剛汰,宮崎麻紗美, 秋山遼太, 水谷正治, 野川俊彦, 越野広雪, 佐藤裕介, 日野智也, 永野真吾
  • Organizer: 2023 International Joint Meeting of the 23rd International Conference on Cytochrome P450 and the 38th Annual Meeting of the Japanese Society for the Study of Xenobiotics
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] X-ray structural analysis of CYP85A3 involved in biosynthesis of highly active brassinosteroids (2023)
  • Author(s): 〇児島よしの、眞鍋菜緒子、藤山敬介、大西利幸、水谷正治、佐藤裕介、日野智也、永野真吾
  • Organizer: 2025 International Joint Meeting of the 23rd International Conference on Cytochrome P450 and the 38th Annual Meeting of the Japanese Society for the Study of Xenobiotics
• [Presentation] Structural and functional analysis of the substrate transfer pathway of alkane hydroxylase AlkB (2023)
  • Author(s): 〇日野智也、岡本貴樹、佐藤裕介、永野真吾
  • Organizer: 2025 International Joint Meeting of the 23rd International Conference on Cytochrome P450 and the 38th Annual Meeting of the Japanese Society for the Study of Xenobiotics
• [Presentation] ヒト由来アデノシン受容体の細胞膜発現量向上を目指した部位特異的飽和変異導入とスクリーニング (2023)
  • Author(s): 〇山下瑛理香、中嶋萌生、岡部勇輝、安田賢司、村田武士、佐藤裕介、永野真吾、日野智也
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会
• [Presentation] Functional modification of 2-oxoglutarate dependent dioxygenases that oxidatively metabolize tomatine (2023)
  • Author(s): 〇吉岡剛汰,宮崎麻紗美, 秋山遼太, 水谷正治, 野川俊彦, 越野広雪, 佐藤裕介, 日野智也, 永野真吾
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会
• [Presentation] アンタゴニスト結合型ヒト由来TRPV3のクライオ電子顕微鏡構造解析 (2023)
  • Author(s): 〇篠田幸太朗、影井華香、長谷川恵嗣、遠藤鴻志郎、前田朋輝、重松秀樹、佐藤裕介、永野真吾、日野智也
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会
• [Presentation] The Lys48-linked polyubiquitin chain specific recognition mechanism by the UBA2 domain of the proteasome shuttle factor RAD23B (2023)
  • Author(s): 〇金澤豪、瓜島絢、角田海斗、日野智也、永野真吾、佐藤裕介
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会
• [Presentation] UPS関連酵素ヒトUCH37の分裂酵母ホモログUch2のユビキチン鎖切断活性の解析 (2023)
  • Author(s): 〇徳久歩乃佳、吉岡直亮、日野智也、永野真吾、佐藤裕介
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会
• [Presentation] 新規甲状腺癌バイオマーカーである抗WDR1抗体の高感度検出を目指したヒトWDR1の調製 (2023)
  • Author(s): 〇池田 泰輝、伊澤 正一郎、佐藤 裕介、永野 真吾、日野 智也
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会
• [Presentation] UBXタンパク質のp97活性亢進ドメインの同定 (2023)
  • Author(s): 〇佐藤裕介、安本菜那子、日野智也、永野 真吾
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会
• [Presentation] 複雑な梯子状疎水基を生産するアナモックス菌のアシルキャリアプロテインとSAM依存性メチル基転移酵素の相互作用に関する構造生物学に基づいた考察 (2023)
  • Author(s): 〇上垣哲心、竹井大誉、山口修平、藤山啓介、佐藤祐介、日野智也、永野真吾
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会
• [Presentation] 温度感受性チャネルTRPV4のクライオ電子顕微鏡による単粒子解析 (2023)
  • Author(s): 桝さつき、湯口尚悟、石井拓海、細川航輔、重松秀樹、佐藤裕介、永野真吾、〇日野智也
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会
• [Presentation] 苦味物質トマチンを酸化的に代謝する酵素群の基質結合型結晶構造に基づいたメカニズムの解明と機能変換 (2023)
  • Author(s): 吉岡剛汰，宮崎麻紗美，藤山啓介，佐藤裕介，日野智也，秋山遼太，水谷正治，野川俊彦，越野広雪，○永野真吾
  • Organizer: 第96回日本生化学会大会
• [Presentation] プレートスキャンシステムを用いたTRPV3の新規微結晶化条件の探索 (2023)
  • Author(s): ◯日野智也、遠藤鴻志郎、篠田幸太朗、永野真吾
  • Organizer: 高速分子動画 国際シンポジウム2023
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 脂質nanodiscに再構成した温度感受性チャネルTRPV4のCryo-EMによる単粒子解析に向けて (2022)
  • Author(s): 〇桝さつき、細川航輔、重松秀樹、佐藤裕介、永野真吾、日野智也
  • Organizer: 第48回生体分子科学討論会
• [Presentation] 高速分子動画でTRPチャネルの温度センサーを見極める (2022)
  • Author(s): 〇日野智也、桝さつき、遠藤鴻志郎、永野真吾
  • Organizer: 新学術領域「高速分子動画」国際シンポジウムThe molecular movies and beyond
  • Int'l Joint Research