シリアルフェムト秒結晶構造解析に基づく銅含有アミン酸化酵素の触媒機構の解明
Publicly Offered Research
| Project Area | Non-equilibrium-state molecular movies and their applications |
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| Project/Area Number |
22H04757
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Complex systems
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| Research Institution | Osaka Medical and Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
村川 武志 大阪医科薬科大学, 医学部, 助教 (90445990)
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| Project Period (FY) |
2022-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,630,000 (Direct Cost: ¥5,100,000、Indirect Cost: ¥1,530,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
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| Keywords | トパキノン / SFX / シリアルフェムト秒結晶構造解析 |
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| Outline of Research at the Start |
酵素が化学反応を効果的かつ特異的に進めるには，触媒各段階における活性部位環境の最適化が必須であり，これにより活性化エネルギーの低減，反応特異性などが可能となる．タンパク質のダイナミクスに基づくこれらの視点は，触媒反応を解明するうえで，今後さらに重要性を増すと考えられるが，現時点では，高速で切り替わる各触媒過程を精密に観測することは難しく，抜本的新規測定法の確立が必要となる．本研究では土壌細菌由来の銅含有アミン酸化酵素（AGAO）について，微結晶溶液と基質溶液の二液混合時分割SFX測定を行う．得られたデータに計算化学などの解析結果を加え，酵素触媒の極めて速い反応過程を可視化する．
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では土壌細菌由来の銅含有アミン酸化酵素（AGAO）について，微結晶溶液と基質溶液の二液混合時分割シリアルフェムト秒結晶構造解析(SFX)を行い，反応時間軸に沿った様々な構造情報を得る．得られた知見により，これまで未解明であった，本酵素の触媒過程の各段階における活性部位環境の最適化，およびそれに基づく反応促進機構の詳細を明らかにすることを目指す．
本年度は，前年度までに確立した測定条件に沿って，嫌気条件下における二液混合時分割SFXを実施した．試料であるAGAOは，大腸菌を宿主として発現し精製し，微結晶は，ミクロシーディング法とバッチ法を組み合わせることにより得た．リキットジェット法を用いた微結晶液と基質溶液の二液混合SFX測定はSACLA BL2にて実施した．
SFX測定について，本年度までに，基質との混合後0から1秒までの計８セットのデータを取得した．得られたデータについてはプログラムCrystfelを用いて指数付けおよび積分を行った．各測定条件とも50000 - 70000枚程度のイメージファイルに対しindexを付けることに成功した．上記の積分したデータを用いて，これまでに放射光X線を用いて決定した構造（3WA2）を用いて分子置換及び精密化を行い，補酵素TPQ及び，生成物であるフェニルアセトアルデヒドについてオミットマップを描き，反応中間体の同定を行ったところ，反応時間軸に沿った様々な構造変化を確認することができた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は，前年度までに確立した試料（微結晶）調製条件と測定条件に従い，微結晶溶液と基質溶液の二液混合時分割SFX測定を実施した．反応時間に沿って複数個の構造決定に成功し，結晶内で構造が大きく変化することが明確に確認できている．
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| Strategy for Future Research Activity |
令和四年度までに反応過程のおおよその構造変化を解析できたので，令和五年度ではさらに踏み込んだ測定を行う．具体的にはpHや基質を変えるなどして，これまで明らかにされていない，触媒反応の初期過程の解析を行うことなどを検討している．
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Report
(1 results)
Research Products
(5 results)
