Molecular movie for nitric oxide reduction at the active site of metalloenzyme

• Project Area: Non-equilibrium-state molecular movies and their applications
• Project/Area Number: 22H04760
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Research in a proposed research area)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Complex systems
• Research Institution: University of Hyogo (2023); Institute of Physical and Chemical Research (2022)
• Principal Investigator: 當舎 武彦 兵庫県立大学, 理学研究科, 教授 (00548993)
• Project Period (FY): 2022-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥6,630,000 (Direct Cost: ¥5,100,000、Indirect Cost: ¥1,530,000); Fiscal Year 2023: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000); Fiscal Year 2022: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
• Keywords: 時間分解構造解析 / 金属酵素 / ヘム / 一酸化窒素 / ケージド化合物 / 反応中間体 / X線自由電子レーザー

Outline of Research at the Start

地球上の窒素循環において、窒素固定により切断されたN-N結合の再生を触媒し、窒素化合物のバランス維持において重要な膜結合型一酸化窒素還元酵素（NOR)を対象とする。NORはヘム鉄と非ヘム鉄からなる活性中心において、電子伝達およびプロトン化を巧妙に行うことで、化学結合の形成（N-N結合）と開裂（N-O結合）を円滑に行うことができる。そのため、多くの研究者がその反応機構の解明を目指してきたが、未だ反応中間体の構造は解明されておらず、詳細な反応機構の理解に至っていない。そこで、この現状を打破するために、SACLAを利用した時間分解構造解析により、NORの反応中間体の構造を決定することに挑戦する。

Outline of Annual Research Achievements

膜結合型一酸化窒素還元酵素（NOR）は、ヘム鉄および非ヘム鉄からなる複核活性中心において、細胞毒である一酸化窒素（NO）の還元反応を触媒する。NORによるNO還元の化学についての理解を深めるために、本課題では、X線自由電子レーザー（XFEL）を利用した時間分解X線結晶構造解析によりNORの反応中間体の構造を明らかにすることを目的としている。溶液試料を用いた実験から、紫外光照射によりNOを発生するケージドNOを反応開始のトリガーとした時間分解分光計測が可能であることを示してきており、本課題では、これを結晶試料に適用する。NORによるNO還元反応は、還元型NORとNOが反応することで開始されるので、還元型NORの酸素分子による自動酸化を防ぐ必要がある。つまり、嫌気条件下での時間分解X線構造解析が必要となる。そのために、酸素分子を透過させない酸素バリア性フィルムを用いてNORの結晶試料を包み込んでＸ線回折実験を行うことを提案し、酸素バリア性フィルムを結晶化プレートとして、NORの結晶を得る方法を確立してきた。
本年度は、酸素バリア性フィルムを用いた手法に関して、新たな取り組みとして、海外研究協力者であるDiamond Light Sourceのグループが開発したX線ポンプ・プローブ法の導入を検討した。本手法では、SACLAからのX線をアッテネータにより弱くしたものを励起光源として利用し、はじめに金属活性中心の還元を行う。その後、アッテネータを利用していないXFEL光を利用することで、還元後の酵素の回折データを得るというものでる。本研究期間内には、NORを用いて、本手法を用いた時間分解構造解析を行うまでには、至らなかったが、別の試料での予備結果を得た。今後は、このX線ポンプ・プローブ法とケージドNOを用いた時間分解構造解析を組み合わせることで、NORの反応中間体の構造解析に取り組む。

Research Progress Status

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和5年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Diamond Light Source/エッセクス大学/インペリアルカレッジロンドン(英国)
• [Int'l Joint Research] ゴッセンベルグ大学(スウェーデン)
• [Int'l Joint Research] Diamond Light Source/University of Liverpool/University of Essex(英国)
• [Journal Article] A redox switch allows binding of Fe(II) and Fe(III) ions in the cyanobacterial iron-binding protein FutA from <i>Prochlorococcus</i> (2024)
  • Author(s): Bolton,Machelett.Stubbs,Axford,Caramello,Catapano,Mal,Rodrigues,Cordery,Tizzard,MacMillan,Engilberge,von Stetten,Tosha,Sugimoto,Worrall,Webb,Zubkov,Coles,Mathieu,Steiner,Murshudov,Schrader,Orville,Royant,Evans,Hough,Owen,Tews
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 121 Issue: 12 Pages: 1-6
  • DOI: 10.1073/pnas.2308478121
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Catalytic Oxidation of Methane by Wild-Type Cytochrome P450BM3 with Chemically Evolved Decoy Molecules (2023)
  • Author(s): Ariyasu Shinya、Yonemura Kai、Kasai Chie、Aiba Yuichiro、Onoda Hiroki、Shisaka Yuma、Sugimoto Hiroshi、Tosha Takehiko、Kubo Minoru、Kamachi Takashi、Yoshizawa Kazunari、Shoji Osami
  • Journal Title: ACS Catalysis Volume: 13 Issue: 13 Pages: 8613-8623
  • DOI: 10.1021/acscatal.3c01158
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Serial Femtosecond Crystallography Reveals that Photoactivation in a Fluorescent Protein Proceeds via the Hula Twist Mechanism (2023)
  • Author(s): Fadini Alisia et al.
  • Journal Title: Journal of the American Chemical Society Volume: 145 Issue: 29 Pages: 15796-15808
  • DOI: 10.1021/jacs.3c02313
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Time-resolved serial crystallography to track the dynamics of carbon monoxide in the active site of cytochrome c oxidase (2023)
  • Author(s): Safari Cecilia et. al.
  • Journal Title: Science Advances Volume: 9 Issue: 49 Pages: 1-12
  • DOI: 10.1126/sciadv.adh4179
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Trapping of a Mononitrosyl Nonheme Intermediate of Nitric Oxide Reductase by Cryo-Photolysis of Caged Nitric Oxide (2023)
  • Author(s): Takeda Hanae、Shimba Kanji、Horitani Masaki、Kimura Tetsunari、Nomura Takashi、Kubo Minoru、Shiro Yoshitsugu、Tosha Takehiko
  • Journal Title: The Journal of Physical Chemistry B Volume: 127 Issue: 4 Pages: 846-854
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.2c05852
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Structural basis for heme detoxification by an ATP-binding cassette?type efflux pump in gram-positive pathogenic bacteria (2022)
  • Author(s): Nakamura Hiro、Hisano Tamao、Rahman Md. Mahfuzur、Tosha Takehiko、Shirouzu Mikako、Shiro Yoshitsugu
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 119 Issue: 27
  • DOI: 10.1073/pnas.2123385119
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Single crystal spectroscopy and multiple structures from one crystal (MSOX) define catalysis in copper nitrite reductases (2022)
  • Author(s): Rose Samuel L.、Baba Seiki、Okumura Hideo、Antonyuk Svetlana V.、Sasaki Daisuke、Hedison Tobias M.、Shanmugam Muralidharan、Heyes Derren J.、Scrutton Nigel S.、Kumasaka Takashi、Tosha Takehiko、Eady Robert R.、Yamamoto Masaki、Hasnain S. Samar
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 119 Issue: 30
  • DOI: 10.1073/pnas.2205664119
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Complementarity of neutron, XFEL and synchrotron crystallography for defining the structures of metalloenzymes at room temperature (2022)
  • Author(s): Moreno-Chicano, Carey, Axford, Beale, Doak, Duyvesteyn, Ebrahim, Henning, Monteiro, Myles, Owada, Sherrell, Straw, Srajer, Sugimoto, Tono, Tosha T., Tews, Trebbin, Strange, Weiss, Worrall, Meilleur, Owen, Ghiladi, Hough
  • Journal Title: IUCrJ Volume: 9 Issue: 5 Pages: 610-624
  • DOI: 10.1107/s2052252522006418
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Serial Femtosecond Crystallography Reveals the Role of Water in the One- or Two-Electron Redox Chemistry of Compound I in the Catalytic Cycle of the B-Type Dye-Decolorizing Peroxidase DtpB (2022)
  • Author(s): Lucic Marina、Wilson Michael T.、Tosha Takehiko、Sugimoto Hiroshi、Shilova Anastasya、Axford Danny、Owen Robin L.、Hough Michael A.、Worrall Jonathan A. R.
  • Journal Title: ACS Catalysis Volume: 12 Issue: 21 Pages: 13349-13359
  • DOI: 10.1021/acscatal.2c03754
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Identifying antibiotics based on structural differences in the conserved allostery from mitochondrial heme-copper oxidases. (2022)
  • Author(s): Nishida Y, Yanagisawa S, Morita R, Shigematsu H, Shinzawa-Itoh K, Yuki H, Ogasawara S, et al
  • Journal Title: Nat Commun. Volume: 13 Issue: 1 Pages: 7591-7591
  • DOI: 10.1038/s41467-022-34771-y
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 嫌気呼吸酵素を標的とした緑膿菌の抗菌薬開発に向けて (2023)
  • Author(s): 當舎武彦、川上凌平、Chai Gopalasingam、重松秀樹、西田優也、新谷泰範
  • Organizer: 第2回生命金属科学シンポジウム
• [Presentation] ケージド基質の低温光解離を利用した金属酵素反応中間体の捕捉 (2023)
  • Author(s): 當舎武彦、武田英恵、榛葉幹治、堀谷正樹、城宜嗣
  • Organizer: 第49回生体分子科学討論会
• [Presentation] Characterization of reaction intermediates of nitric oxide reductases involved in denitrification (2023)
  • Author(s): Takehiko Tosha
  • Organizer: ThermusQ高度好熱菌研究を切り拓くネオテクノロジー
• [Presentation] Characterization of the short-lived reaction intermediate of NO reductase with caged substrate (2023)
  • Author(s): Takehiko Tosha
  • Organizer: Dynamic Crystallography-XFELs and Synchrotrons to study enzyme reactions
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Mechanism of nitric oxide reduction by P450 in fungal denitrification (2023)
  • Author(s): Takehiko Tosha
  • Organizer: 日本薬物動態学会第38回年会/第23回シトクロムP450国際会議国際合同大会
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] NO reduction chemistry at heme/non-heme binuclear active center proved by methods using photo-sensitive caged NO (2022)
  • Author(s): Takehiko Tosha
  • Organizer: 10th Asian Biological Inorganic Chemistry Conference
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Mechanism of biological nitric oxide reduction proved by time-resolved structural analysis (2022)
  • Author(s): Takehiko Tosha
  • Organizer: REDOX WEEK IN SENDAI 2022, 4th International conference on persulfide and sulfur metabolism in biology and medicine
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Elucidation of Mechanisms for Catalytic Reaction of Nitric Oxide Reductases by Time-resolved Techniques (2022)
  • Author(s): T. Tosha, H. Takeda, Y. Shiro, M. Kubo
  • Organizer: International Conference on Porphyrins and Phthalocyanines (ICPP)-12
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 光解離性基質の低温光解離を利用した金属酵素短寿命反応中間体の同定 (2022)
  • Author(s): 當舎武彦
  • Organizer: 第61回電子スピンサイエンス学会年会
  • Invited
• [Presentation] 光解離性ケージド基質を用いた金属酵素反応機構の解明 (2022)
  • Author(s): 當舎武彦
  • Organizer: メタルバイオサイエンス研究会2022
  • Invited
• [Presentation] 酸素バリア性フィルムを利用した嫌気下での構造解析の試み (2022)
  • Author(s): 當舎武彦、榛葉幹治、松浦滉明、平田邦生、山本雅貴、城宜嗣
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会年会
• [Presentation] 金属酵素活性中心における一酸化窒素還元反応の分子機構 (2022)
  • Author(s): 當舎武彦
  • Organizer: 物性研短期研究会「理論タンパク質物性科学の最前線：理論と実験との密な協働」
  • Invited
• [Presentation] 各種分光計測を駆使した鉄活性中心における一酸化窒素還元酵素の反応機構の解明 (2022)
  • Author(s): 當舎武彦
  • Organizer: 第22回日本蛋白質科学会年会
  • Invited
• [Remarks] 反応途中の酵素を観る新手法の開発
  • URL: https://www.riken.jp/press/2023/20230111_2/index.html